小RNA干扰PCBP2在神经胶质瘤细胞中对P53相关基因的调节和对细胞增殖的影响

韩 为，阴 彬，彭小忠

(中国医学科学院 基础医学研究所 北京协和医学院 基础学院 生物化学与分子生物学系 医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)

研究论文

小RNA干扰PCBP2在神经胶质瘤细胞中
对P53相关基因的调节和对细胞增殖的影响

韩 为，阴 彬，彭小忠*

(中国医学科学院 基础医学研究所 北京协和医学院 基础学院 生物化学与分子生物学系
医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)

目的探索多聚胞嘧啶结合蛋白2(PCBP2)表达下调对相关基因和胶质瘤细胞增殖的影响。方法3株神经胶质瘤细胞系(T98G、U87MG和U251)各分为2组，分别转入特异性靶向PCBP2基因的小干扰RNA(siRNA)和对照siRNA，用Western blot法检测siRNA对PCBP2蛋白的抑制效果及对P53蛋白和它的两个靶基因PUMA和BAX的表达影响，同时检测P53共调节因子FHL2和同家族成员FHL1表达变化。用生物素pull-down分析PCBP2是否和FHL家族成员mRNA结合。用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入法检测细胞增殖能力，Hoechst染色观察细胞凋亡率。结果PCBP2 siRNA转染这3株细胞后使PCBP2蛋白表达水平明显下调(Plt;0.05)；增加P53及它的靶基因PUMA和BAX的蛋白表达(Plt;0.05)；抑制FHL2蛋白(Plt;0.05)，但并不结合其mRNA的3′非编码区(3′UTR)；BrdU阳性细胞减少(Plt;0.05)；Hoechst染色阳性细胞增多(Plt;0.05)。结论抑制PCBP2表达可以增强胶质瘤细胞中P53通路活性，并减弱细胞增殖能力，诱导细胞凋亡。

RNA干扰；多聚胞嘧啶结合蛋白2；P53；细胞增殖；细胞凋亡

人神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，占颅内肿瘤的40%～60%，属国内十大高发肿瘤之一，在欧美国家发病率更高，极大影响患者的健康和生活质量[1]。胶质瘤的发生机制迄今尚不清楚，相关研究表明，P53基因的突变、缺失与胶质瘤的发生发展密切相关，是导致该瘤发生的重要事件[2]。P53是一个广泛表达与真核细胞中的抑癌基因，并且它作为一个重要的转录因子，可以调节上百种功能各异的靶基因[3]。4个半LIM结构域(four-and-a-half-LIM domain, FHL)家族成员FHL2可以作为共调节因子与P53一起调控细胞周期，诱导细胞凋亡等生理作用[4]。研究显示，多聚胞嘧啶结合蛋白2[poly(C) binding protein 2, PCBP2]在神经胶质瘤中高表达，并且可以结合FHL家族另一成员FHL3 mRNA的3′非编码区(3′UTR)，负性调节其mRNA稳定性，进而影响FHL3基因表达[5]。本研究利用小干扰RNA(siRNA)在3种神经胶质瘤细胞系中敲低PCBP2，检测P53通路蛋白和FHL家族其他蛋白的表达变化，并观察了抑制PCBP2表达对细胞功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

T98G和U87MG细胞(ATCC)；U251细胞、胰蛋白酶、双抗(中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)；MEM/EBSS和胎牛血清(Gibco公司)；PCBP2 siRNA(上海吉玛制药技术有限公司合成)序列为：5′-GGCCTATACCATTCAAGGA-3′；用于Biotin pull-down的探针引物(英骏生物技术有限公司)序列如下：FHL1-3′A 上游：5′-GGAATTCAGGGGCTCCT GTCCTGTAAA-3′，下游：5′-CGGGATCCCTGCAACTC TTGCATGTCGT-3′；FHL1-3′B 上游：5′-GGAATTCCA TCAGAACTCTGCCCTTCC-3′，下游：5′-CGGGATCCT CAGCACTGCAGGAACATCT-3′；FHL1-3′C上游：5′-GG AATTCTCTAGAGGGGGAGTTGAGCA-3′，下游：5′-C GGGATCCAGGCATCAGCTTCTCTAACCA-3′；FHL2-3′UTR 上游：5′-GGAATTCTTCTTTCTCACCCAGGCA AT-3′，下游：5′-CGGGATCCGGTTTAGACTTGACGC AACG-3′；FHL3-3′A 上游：5′-CGGGATCCCAGGACT GTGGCTCCTTTTC-3′，下游：5′-CCCAAGCTTGCACC CATAGGAGACCTGAA-3′；FHL3-3′B上游：5′-CGGG ATCCGGACTGTTCTCAGGCTTGAC-3′，下游：5′-CC CAAGCTTCACACCGCTTTATTGCAG AATC-3′；Lipofectamin 2000、Opti-MEM(Invitrogen公司)；β-actin抗体(Sigma公司)；P53抗体(sc-25373)、FHL2抗体(sc-52667)(Santa Cruz公司)；PUMA抗体(4976s)、BAX(2772s)(Cell Signaling公司)；PCBP2抗体(ARP40568)(北京奥维亚生物技术有限公司)；FHL1抗体(10991-1-AP)(Proteintech公司)；Streptavidin Sepharose珠子(GE公司)； Biotin RNA Labeling Mix和Mini Quick Spin Column(Roche公司)；pGEM-3Zf载体(Promega公司)；体外转录试剂盒(TaKaRa公司)；胞质胞核分步提取试剂盒(Thermo公司)；细胞凋亡-Hoechst染色盒(33258，碧云天公司)。

1.2 细胞培养

人神经胶质瘤细胞T98G、U87MG和U251培养于含10%胎牛血清的MEM培养基中。所有细胞置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，按1∶2细胞每2～3 d传代1次。

1.3 siRNA转染胶质瘤细胞

转染前1天，用胰蛋白酶进行消化以收获对数期生长的细胞，计数后以(1～3)×105个/mL接种到相应的孔板中，培养过夜至细胞达到50%～70% 汇合时进行转染；转染前1～2 h更换无双抗的新鲜培养基；配制转染体系(以12孔板为例)：在两个无菌的1.5 mL离心管中各加入100 μL opti-MEM培养液。在其中一个加入100 pmol siRNA，另一个加入2 μL Lipofectamine 2000，单独混匀后室温放置5 min，然后将两管溶液轻轻混合均匀，室温放置20 min；将混合液逐滴加入培养板中，轻轻混匀。孵箱中培养4～6 h后更换含双抗的新鲜培养基。48 h后根据实验需要观察或收集细胞。

1.4蛋白提取和Westernblot检测PCBP2和P53相关基因表达

[6]。

1.5 体外转录生物素标记的RNA探针

将测序正确的FHL1的3′UTR上A(3′A)、B(3′B)、C(3′C)、FHL2的3′UTR、FHL3的3′UTR上A(3′A)和B(3′B)分别连入pGEM-3Zf载体中，将载体单酶切线性化作为DNA模板。然后按照体外转录试剂盒说明书配制反应液(加入Biotin RNA Labeling Mix 2 μL)，37 ℃反应60 min。取Mini Quick Spin Column纯化 RNA探针。

1.6生物素pull-down分析PCBP2与FHL家族成员3′UTR的相互作用

按照胞质胞核分步提取试剂盒说明书分别提取胞质蛋白和核蛋白，合并作为总蛋白(input)进行分析。后续步骤见参考文献[5]。

1.7 BrdU掺入检测细胞增殖能力

见参考文献[6]。

1.8 Hoechst染色检测细胞凋亡

按照碧云天细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒说明书对细胞进行染色，荧光显微镜下观察。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1敲低PCBP2对P53蛋白和其靶基因表达的影响

转染PCBP2 siRNA到T98G、U87MG和U251这3株神经胶质瘤细胞系中，可以明显抑制PCBP2蛋白的表达(图1A)。PCBP2表达下调后，可以增强P53蛋白表达；同时本研究还检测到P53的靶基因PUMA和BAX的蛋白水平也有上调(图1B)。

2.2 敲低PCBP2对FHL家族蛋白表达的影响

在3株胶质瘤细胞中敲低PCBP2表达可以抑制FHL2蛋白表达，但对FHL1蛋白水平没有明显的影响(图2A)。

2.3PCBP2与FHL家族成员mRNA3′UTR的相互作用分析

针对FHL家族主要成员FHL1、FHL2和FHL3 mRNA的3′UTR上富含胞嘧啶的序列，本研究发现除了FHL3-3′A与PCBP2可以相互作用，FHL1和FHL2的3′UTR均不能结合PCBP2(图2B,C)。

1.control siRNA; 2.PCBP2 siRNA;*Plt;0.05 compared with control siRNA图1 转染PCBP2 siRNA对神经胶质瘤细胞中P53蛋白及其靶基因的影响Fig 1 Effect of PCBP2 siRNA on the expression of P53 protein and its target genes in glioma cells

2.4 敲低PCBP2对胶质瘤细胞增殖能力的影响

红色荧光显示BrdU阳性的细胞，蓝色显示的是通过DAPI染色视野中所有细胞的胞核。敲低PCBP2表达后，T98G细胞中的BrdU阳性细胞率平均值从49.0%下降到28.4%；U87MG细胞则从40.8%下降到23.4%；U251细胞中的平均BrdU阳性细胞率也从51.6%下降到28.0%(Plt;0.05)(图3)。

2.5 敲低PCBP2对胶质瘤细胞凋亡率的影响

敲低PCBP2的3株神经胶质瘤细胞中的Hoechst染色阳性的细胞数比例较对照组(control siRNA)明显增加(Plt;0.05)(图4)。

1.control siRNA; 2.PCBP2 siRNA; *Plt;0.05 compared with control siRNA图2 转染PCBP2 siRNA对FHL家族蛋白的影响Fig 2 Effect of PCBP2 siRNA on the expression of FHL proteins

*Plt;0.05 compared with control siRNA图3 BrdU掺入法检测转染PCBP2 siRNA对神经胶质瘤细胞增殖的影响

*Plt;0.05 compared with control siRNA图4 Hoechst染色检测转染PCBP2 siRNA对神经胶质瘤细胞凋亡的影响

3 讨论

PCBP2因其能与球蛋白的3′UTR上富含胞嘧啶(C)的序列特异性结合，以前又被称为αCP2[7]。本研究的结果显示PCBP2参与到P53通路中，提示该蛋白可能在肿瘤的发生发展中发挥重要的调节作用。同时本研究在3株神经胶质瘤细胞中观察到敲低PCBP2蛋白对细胞增殖和抗凋亡能力的抑制作用，暗示PCBP2具有促进神经胶质瘤的恶性进展的原癌样基因功能。

在DNA损伤刺激下，P53能够促进凋亡基因的转录。PUMA又称作P53上调凋亡调控因子，它的启动子区存在两个P53结合区，与P53蛋白的结合对于PUMA的转录非常重要[8]。BAX基因属于BCL-2基因家族，对BCL-2产生阻抑作用，也是极重要的促细胞凋亡基因。P53能够直接激活BAX，诱导BAX寡聚，介导凋亡[9]。

FHL家族包括FHL1～FHL5共5个成员。FHL2被发现在神经胶质瘤中高表达，并促进肿瘤的生长和迁移[10]。同时FHL2还可以与P53和HIPK2形成复合物，共同介导P53诱导的转录调节[4]。本研究在前期工作基础上发现PCBP2除可以调节FHL3，还可以调节FHL2表达，但与FHL3的调节机制不同的是，PCBP2并不能结合FHL2的mRNA上3′UTR，具体调节的分子机制还有待进一步探索。

参考文献：

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[4] Lee SW, Kim EJ, Um SJ. FHL2 mediates p53-induced transcriptional activation through a direct association with HIPK2 [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 339: 1056- 1062.

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Knockdown of PCBP2 with small interferingRNA regulates P53 related genes and cell proliferation of glioma cells

HAN Wei, YIN Bin, PENG Xiao-zhong*

(State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Dept. of Biochemistry and Molecular Biology,Institute of Basic Medical Sciences, CAMS amp; PUMC, Beijing 100005, China)

ObjectiveTo study the effect of poly(C) binding protein 2 (PCBP2) silencing on P53 related genes and glioma cell proliferation.MethodsPCBP2 gene-specific siRNA or control siRNA was transfected into three glioma cell lines (T98G, U87MG and U251). The expression levels of PCBP2 protein, P53 and its target genesPUMAandBAX, P53 co-regulator FHL2 and another member of the Four-and-a-half-LIM domain (FHL) family FHL1 were detected by Western blot. The interactions between PCBP2 and FHL family members′ mRNA were analyzed by Biotin pull-down. Cell proliferation was determined by BrdU incorporation. The apoptosis ratio of cells was measured by Hoechst staining.ResultsAfter transfection ofPCBP2 siRNA, PCBP2 protein was evidently silenced; the protein levels of P53 and its target genes PUMA and BAX were increased (Plt;0.05); the protein level of FHL2 was decreased (Plt;0.05) but its mRNA 3′UTR didn′t bind to PCBP2, the BrdU positive cells decreased (Plt;0.05); the number of Hoechst positive cells increased (Plt;0.05).ConclusionsKnockdown of PCBP2 can enhance the activity of P53 pathway in glioma cells with the weakened ability of cell proliferation and induction of cell apoptosis.

RNA interference; poly(C) binding protein 2; P53; cell proliferation; cell apoptosis

2014- 03- 10

2014- 04- 13

国家自然科学基金(31301152)

*通信作者(correspondingauthor)：pengxiaozhong@pumc.edu.cn

1001-6325(2014)06-0776-06

Q291

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