利用甘蔗尾叶生产蛋白饲料的研究

■李 楠 赵辰龙 周瑞芳 邓智年 张娥珍

(1.广西大学生命科学与技术学院，广西南宁 530005；2.广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，广西南宁 530007；3.广西农业科学院农产品加工研究所，广西南宁 530007)

目前甘蔗种植面积最大的国家是巴西，其次是印度，中国位居第三。而广西占全国甘蔗种植面积的63%[1]。甘蔗收割后的蔗叶和甘蔗榨糖后的糖蜜，都是甘蔗产业的副产品，据估计我国每年产生的蔗叶1 500 t、糖蜜300 t[2]。有效利用这些副产品，实现甘蔗的综合利用，将会增加甘蔗产业的附加效益，对广西的经济发展有十分积极的意义。

新鲜甘蔗尾叶含水量高达70%，而干燥后的蔗叶约含有30%的粗纤维，7%的粗蛋白质，32%的糖类，7%的有机酸，并含有一定数量的脂肪、淀粉、维生素等[3]，可以代替牧草成为良好的饲料资源，许多研究表明其育肥效果明显[4-8]。甘蔗收获期在11月至翌年4月，甘蔗收获后遗留的蔗叶总量巨大，此时正值枯草期，利用甘蔗尾叶作青饲料，成本低，可以解决越冬渡春时期牧草饲料不足的难题[9－10]。但是甘蔗尾叶的粗纤维含量高，而蛋白质含量较低，依然有较多不足之处。甘蔗糖蜜主要成分为糖类，是生产酵母的优质原料，也可直接用作动物饲料，能大大改善饲料适口性，提高瘤胃微生物的活性，提高采食量和消化能力[11]。还可以起到黏结剂作用，减少饲料粉尘，提高饲料颗粒质量等优点[12]。

为解决甘蔗尾叶作为饲料的存在诸多问题，本实验使用糖蜜弥补蔗叶纤维含量高、蛋白含量低的缺点，确定了多菌种混合半固态发酵工艺条件，适当的降解部分纤维，同时提高发酵产品的蛋白质含量，改善适口性和营养价值，综合利用甘蔗糖业副产品生产具有较高营养价值的饲料。利用甘蔗尾叶与糖蜜生产饲料能够有效降低饲料生产成本，又能实现资源的综合利用，避免蔗叶燃烧和糖蜜酒精废液带来的污染，实现蔗糖业与养殖业的互相促进和可持续发展，为甘蔗资源的综合利用和拓展饲料资源提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株来源：绿色木霉，产朊假丝酵母（广西大学食品发酵研究所保藏）。

甘蔗尾叶：广西农业科学院武鸣实验基地实验田种植。

甘蔗糖蜜：广西南宁糖业股份有限公司明阳糖厂。

1.2 培养基

斜面培养基：20%马铃薯汁1 L，蔗糖20.0 g（国药集团化学试剂有限公司），KH2PO43 g（国药集团化学试剂有限公司），MgSO4·7H2O 1.5 g（国药集团化学试剂有限公司），硫胺素8 mg（国药集团化学试剂有限公司），琼脂20.0 g（北京奥博星生物技术有限责任公司），pH值6.5。

种子培养基：20%马铃薯汁1 L，蔗糖20.0 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，硫胺素 8 mg，pH值6.5。

固体发酵培养基：蔗叶干燥粉碎后过20目筛，取5 g置于250 ml三角瓶内，以1∶4的固液比加入稀释到12°Bx的甘蔗糖蜜，混合均匀后灭菌。

1.3 主要仪器

XT-200型高速多功能粉碎机(浙江永康红太阳机电有限公司)；BS 423 S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；SPX-250恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；ZDDN-II自动凯氏定氮仪(浙江托普仪器有限公司)等仪器。

1.4 试验方法

1.4.1 斜面培养

在无菌操作台上用接种针挑取少量待接菌体移入相应的斜面培养基，于28℃恒温培养，木霉培养5～7 d，酵母菌培养2 d。

1.4.2 种子液的制备

向接斜面试管中接入3 ml无菌水，用接种针刮取适量菌体，接入250 ml的三角瓶中，装液量为50 ml，28℃、180 r/min培养24 h。

1.4.3 固态发酵

接种适量的木霉和酵母菌液体种子至固体发酵培养基，使用玻璃棒搅拌，充分混合后恒温静置培养，培养期间定时翻料。

1.4.4 发酵条件优化试验

暂定初始发酵条件：固液比为1∶4，糖蜜锤度12°Bx，pH值为7，总接种量为40%，木霉与酵母的接种比例为1∶1，培养温度28℃，发酵时间5 d。考察不同因素对产品粗蛋白质含量的影响。

发酵时间：其他条件为初始条件，接种后分别培养4、5、6、7、8 d后测定发酵产物中的粗蛋白质含量。

总接种量：分别按40%、50%、60%、70%、80%的总接种量接种，发酵结束后分别测定发酵产物中的粗蛋白质含量。

固液比：将干物料与稀释糖蜜分别按1∶1；1∶2；1∶3；1∶4；1∶5；1∶6的比例混合后制备培养基，发酵结束后分别测定发酵产物中的粗蛋白质含量。

糖蜜pH值：只改变稀释糖蜜的pH值，分别调整糖蜜的pH值为6、6.5、7、7.5、8，发酵结束后分别测定发酵产物中的粗蛋白质含量。

糖蜜锤度：分别将糖蜜稀释为12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32 °Bx后配制发酵培养基，发酵结束后分别测定发酵产物中的粗蛋白质含量。

接种比例：总接种量为40%，将木霉与酵母按不同比例接种（2∶1；1∶1；1∶2；1∶3；1∶4），发酵结束后分别测定发酵产物中的粗蛋白质含量。

1.4.5 粗蛋白质（CP）的测定方法

发酵完成后将样品置于60℃烘箱干燥后，按照GB/T 6432-1994中方法测定粗蛋白质含量。

2 结果与分析

2.1 培养时间对粗蛋白质含量的影响(见图1)

从图1可知，在初始培养条件下，随着培养时间的延长，粗蛋白质含量逐渐增加，当培养时间为5 d达到最大。培养时间超过5 d后，粗蛋白质含量则逐渐减少。因此，发酵时间选择5 d最佳。

2.2 接种量对粗蛋白质含量的影响

接种量的大小影响发酵的周期和产量：接种量小，菌体延滞期较长从而延长发酵周期，增加了污染几率和动力消耗；接种量大，有利于充分利用营养物质，缩短发酵周期，降低功耗与成本。分别以40%、50%、60%、70%、80%接种量接入培养基中发酵，菌种比例为1∶1，考察最适接种量。实验结果如图2所示，在总接种量为50%，即单菌接种量为25%时，具有最大的粗蛋白质含量，所以将最佳接种量定为50%。

2.3 固液比对粗蛋白质含量的影响

发酵培养基的固液比对发酵过程有重要的影响。由于糖蜜成分复杂多样，含大量糖类、有机物和无机盐离子，是发酵过程中微生物生长代谢所需要的营养物质主要来源，所以固液比直接影响培养基的碳源、氮源、和无机盐含量。此外固液比也对培养基物理状态有直接影响，液体比例越小，基质越干燥，空隙较多，通气性越好；反之则越接近流体，在静置培养条件下，通气性较差。由于该实验属于好氧发酵，液体比例过少则培养基中营养供应不足，而过多则会影响通气，从而影响菌体生长。所以固液比应适中，在提供足够营养的同时具有一定的通透性，以保证氧的传递。由图3可知，随着液体比例的增大，粗蛋白质含量不断增大；固液比为1∶4时达蛋白质含量最高点，比例为1∶5时粗蛋白质含量与其相差不多；再增加液体比例则粗蛋白质含量不断降低，从节省物料的角度考虑最佳固液比为1∶4。

2.4 pH值对粗蛋白质含量的影响

pH值影响着微生物细胞膜通透性、各种酶的活性、底物结合等多个方面，合适的pH值有利于微生物的繁殖及产物的合成。通过该项实验以确定发酵的最佳pH值。实验结果(见图4)表明：糖蜜pH值为6.5时，粗蛋白质含量最高，故稀释糖蜜的最适pH值为6.5。

2.5 糖蜜锤度对粗蛋白质含量的影响

稀释糖蜜是发酵过程中碳源、氮源和无机盐离子等营养物质的主要提供者，将糖蜜稀释成不同锤度后配制培养基，可以改变各种营养物质的浓度，从而影响菌体生长和产物合成。同时糖蜜锤度也影响着培养基的黏稠度和通气性。结果如图5所示，在糖蜜锤度为28°Bx时，粗蛋白质含量最大。当浓度较低时，培养基不能满足微生物的生长代谢的营养需求，粗蛋白质含量较低；浓度过高则培养基中的色素、金属离子和其他有害物质浓度变大，培养基黏稠度高造成氧气供应不足，从而抑制了微生物的生长代谢，粗蛋白质含量降低。因此，甘蔗糖蜜的最佳锤度为28°Bx。

2.6 菌种比例对粗蛋白质含量的影响

在该发酵体系中，木霉与酵母有不同的分工，互补促进，多菌共同协作提高了对底物的利用率。酵母利用糖蜜中大量的碳源、氮源迅速生长繁殖，消耗大部分的糖类，解除了对木霉纤维素分解酶系的产物抑制作用。木霉在利用一小部分碳源供菌体生长后，将蔗叶纤维素分解为纤维二糖或葡萄糖，而酵母又可以利用这些糖类继续合成菌体蛋白。在总接种量一定的条件下，将木霉与酵母按不同的比例接种，实验结果如图6所示，在木霉与酵母接种比例为1∶1时，粗蛋白质含量最大；不断加大酵母的接种量使得蛋白质含量有增加的趋势，但是大接种量造成营养供应不足，影响酵母生长，粗蛋白质含量无法达到最大值。

2.7 发酵条件正交试验结果

通过对上述单因素试验，初步确定了木霉与酵母共同发酵的最优条件。为了进一步确定各因素的最优组合，以单因素实验为依据，对固液比、接种量、温度、糖蜜锤度进行正交试验，其他条件均保持单因素优化确定的最优条件，利用Latin 3.1版设计正交试验。表1为正交实验设计，表2为正交实验结果与极差分析，表3为方差分析。

表1 正交试验因素和水平

根据正交设计试验结果极差分析可以看出，四个因素的影响顺序为：A＞C＞D＞B，即固液比＞温度＞糖蜜锤度＞接种量，说明该发酵过程中，固液比对粗蛋白质含量影响最大。最佳因素组合为A3B2C1D3，由正交表中结果可知，在固液比为1∶5、接种量为50%、温度26℃、糖蜜锤度28°Bx的条件下，粗蛋白质含量为正交表中最大值23.41%，比初始条件下的14.81%提高了8.6%。因此本实验选择固液比为1∶5、接种量为50%、温度26℃、糖蜜锤度28°Bx为培养条件的最佳组合。

由于正交设计实验中没有空列，故将极差分析中极差最小项作为误差列进行方差分析，由方差分析表（见表3）可知：因素A显著，而因素C和D不显著，因素的作用主次顺序为A＞C＞D，与极差分析结果一致。

表2 发酵条件正交实验结果

3 结论

①本实验以甘蔗尾叶和甘蔗糖蜜为原料，利用木霉和酵母进行混合固态发酵，生产新型的高蛋白饲料，解决了蔗叶用于饲喂的若干问题，开拓了饲料来源的同时实现了糖业副产品的综合利用。

表3 发酵条件正交试验方差分析结果

②通过单因素试验初步确定了培养基的配方及培养条件：糖蜜锤度28°Bx，其pH值为6.5，最优固液比为1∶4，最适培养时间5 d，培养温度为28℃，总菌接种量50%，接种比例1∶1。

③通过正交试验进一步确定了最佳的条件组合：糖蜜锤度28 °Bx，其pH为6.5，最优固液比为1∶5，最适培养时间5 d，培养温度为26℃，总菌接种量50%，菌种比例1∶1。优化的条件下发酵产物中粗蛋白质含量高达23.41%，较优化前提高了8.6%。通过极差分析和正交分析可知，各因素的影响次序为：固液比＞温度＞糖蜜锤度＞接种量，其中固液比对粗蛋白质含量影响显著。