淋球菌对头孢曲松的敏感性及淋球菌多抗原测序分型研究

陈绍椿 尹跃平 戴秀芹 孙厚华 于瑞星 韩燕 陈祥生

·论著·

淋球菌对头孢曲松的敏感性及淋球菌多抗原测序分型研究

陈绍椿 尹跃平 戴秀芹 孙厚华 于瑞星 韩燕 陈祥生

目的探讨南京市淋球菌对头孢曲松的敏感性以及相应菌株的淋球菌多抗原测序分型(NGMAST)基因型别。方法2007年和2012年在中国疾病预防控制中心性病控制中心临床防治基地分别收集了204株和81株淋球菌,经过分离纯化及鉴定后,用琼脂稀释法测定其对头孢曲松的最小抑菌浓度(MIC);菌株培养后利用试剂盒提取DNA,并进行淋球菌多抗原测序分型(NG-MAST)。结果测试的285株淋球菌MIC≥ 0.060 μg/ml的菌株比例为63.2%,MIC≥ 0.125 μg/ml的比例为31.6%。2012年MIC≥ 0.060 μg/ml和MIC≥ 0.125 μg/ml的菌株比例分别为44.4%和11.1%,2007年MIC≥ 0.060 μg/ml和MIC≥ 0.125 μg/ml的菌株比例分别为70.6%和39.7%。NG-MAST分型研究显示,285株淋球菌共有166个型别,菌株多样性较高,其中73种为已知型别,93种为新型别。2007年测定的所有菌株中以ST568(n=13),ST270(n=9),ST421(n=7),ST2288(n=5),ST1731(n=4),ST1766(n=4),ST1866(n=4),ST1870(n=4)等为主。2012年测定的所有菌株中以ST2318(n=5),ST1053(n=4),ST5990(n=4),ST8726(n=4)为主。相同NG-MAST型别的菌株具有相同或相近的MIC值。 结论 2012年与2007年菌株的优势型别有较大变化,某些型别与头孢药敏值有较强对应关系。NG-MAST分型可能作为分子生物学标记用于淋球菌耐药监测。

奈瑟球菌,淋病;抗药性;头孢曲松

淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)感染引起的淋病是常见性传播疾病之一,该病可通过抗生素治愈,现在推荐使用头孢曲松治疗,由于抗生素的广泛应用,淋球菌本身又极易获取外源耐药基因,所以淋球菌对各种抗生素的耐药性不断增加,对头孢曲松的敏感性不断下降[1]。特别令人担忧的是,近年来,

在日本[2]、法国[3]、西班牙[4]发现了对头孢曲松高度耐药的淋球菌菌株,即“超级淋球菌”,甚至还出现了临床治疗失败的病例[2-3，5-10]。近20年耐药监测数据显示,淋球菌对头孢曲松产生低敏的趋势非常快,形势严峻。淋球菌基因分型技术是现有追踪耐药菌株起源及传播的有效方法之一,可了解淋球菌在特定时间和特定地域的遗传和进化。本研究对南京市收集的淋球菌临床菌株进行头孢曲松最小抑菌浓度(MIC)的测定,用淋球菌多抗原测序分型技术(NG-MAST)对所有菌株进行分型研究。

材料和方法

一、菌株收集及头孢曲松MIC的测定

2007年和2012年在中国疾病预防控制中心性病控制中心临床防治基地分别收集了204株和81株淋球菌,经过分离纯化及鉴定后,用琼脂稀释法测定对头孢曲松的MIC[11]。淋球菌基础培养基成分为每500 ml含18 g GC琼脂粉(英国Oxoid公司),50 ml无菌脱纤维羊血(南京便诊生物科技有限公司),培养基中头孢曲松[世界卫生组织(WHO)提供]浓度范围为 0.008 μg/ml～ 0.500 μg/ml。 每批试验用已知MIC值的WHO标准菌株进行质量控制(WHO G、WHO K、WHO L)。菌株完成MIC值测定后-70℃保存于脱脂牛奶管中。

二、DNA提取

菌株统一用淋球菌基础培养基复苏后,刮取平板上菌落于200 μl磷酸缓冲液中混悬均匀,用比浊仪调整菌悬液浓度至0.5麦氏单位。菌体DNA使用德国Qiagen公司生产的QIAxtractor全自动核酸纯化仪提取DNA,所用试剂为仪器配套的QIAxtractor DX Kits。实验操作按照仪器说明书及提取液体样本的试验方案进行,方案如下：向200 μl菌悬液中加入120 μl DXL缓冲液,45℃振荡加热处理1 h。待样本冷却至室温,1 000×g离心10 min。转移300 μl上清至2000 μl样本板中,进行全自动核酸纯化。

三、NG-MAST分型

用Martin等文献报道的方法[12],简述如下：PCR扩增porB基因和tbpB基因,扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳,在正确位置有条带的产物送至北京华大基因公司进行纯化测序。porB基因测序结果与基因库中已知序列(基因库号M21289)进行比对,以M21289序列为参考,截取从第455位碱基开始的490 bp大小的基因片段进入NG-MAST网站比对以获取porB基因的等位基因型别;tbpB基因测序结果与基因库中已知序列(U65222)进行比对,以U65222序列为参考,截取从第1118位碱基开始的390 bp大小的基因片段进入NG-MAST网站比对以获取tbpB基因的等位基因型别;最后再综合porB和tbpB基因的等位基因型别从NG-MAST网站获取该菌株的基因型别。

结 果

一、头孢曲松MIC值的分布

共检测285株淋球菌,MIC测定的浓度范围为 0.008 μg/ml～ 0.500 μg/ml, 有 1株菌 MIC 值为 0.500 μg/ml, 所有菌株中MIC≥ 0.060 μg/ml的菌株比例为 63.2%,MIC≥ 0.125 μg/ml比例为31.6%。两年收集菌株的MIC值分布见表1。2012年MIC值集中于0.030(38.3%)和0.06(33.3%),MIC≥0.060 μg/ml的菌株比例为 44.4%(36/81),2007年MIC值集中于 0.030(24.0%)、0.060(30.9%)和0.125(32.4%),MIC≥0.060μg/ml的菌株比例为70.6%(144/204);2007年和 2012年 MIC ≥ 0.125 μg/ml的比例分别为39.7%(81/204)和11.1%(9/81),χ2检验显示两年MIC≥ 0.125 μg/ml的比例,差异有统计学意义(χ2=21.94,P＜0.01),见图1。

二、NG-MAST型别分布

285株淋球菌共分出166个型别,菌株多样性较高,其中73种为已知型别,93种为新型别。2007年共分出123个型别,其中54种为已知型别,69种为新型别,其中ST568(n=13),ST270(n=9),ST421(n=7),ST2288(n=5),ST1731(n=4),ST1766(n=4),ST1866(n=4),ST1870(n=4)为优势型别;2012年共分出52个型别,其中27种为已知型别,25种为新型别,其中ST2318(n=5),ST1053(n=4),ST5990(n=4),ST8726(n=4)为优势型别。

表1 2007年和2012年临床分离的淋球菌菌株对头孢曲松的MIC值分布(株)

图1 2007年和2012年临床分离淋球菌菌株对头孢曲松在不同MIC值下的分布比例

表2 2007年和2012年特定优势型别对应的头孢曲松MIC值分布(例)

三、不同NG-MAST型别菌株头孢曲松MIC值的分布

从表2中,可发现相同NG-MAST型别的菌株具有相同或相近的MIC值,一般跨度不超过3个浓度级。如 ST568,主要集中于 0.030 μg/ml和 0.060 μg/ml两个浓度,ST270集中于 0.125 μg/ml浓度,而ST1766全部为0.060 μg/ml一个浓度,这些ST型别与头孢曲松MIC值有较强的对应关系。

讨 论

我们一直对中国不同地区淋球菌耐药趋势进行监测,根据文献报道,MIC≥ 0.060 μg/ml的淋球菌可以认为是敏感性下降的菌株[13],结合已有的监测数据显示,1989—1990年MIC≥ 0.060 μg/ml的菌株比例为27.60%(21/76)[14],1999年为17.86%,到了2001年上升到50.00%[13],而我们的研究显示,2007年MIC≥0.060 μg/ml菌株的比例为70.60%,2012年MIC≥ 0.060 μg/ml菌株比例为44.40%。从20世纪90年代至今,MIC≥ 0.060 μg/ml菌株的比例有较大变化,近年来更是保持较高比例。2007年有1株型别为ST2288的菌株,MIC为0.500 μg/ml,是否为耐药菌株还需要进一步确定,国际上现有报道的耐药菌株也没有此型别。两年MIC≥0.125 μg/ml的比例差异有统计学意义,2007年比2012年高,可能与两年收集菌株的构成差异较大有关,我们的分子分型数据也显示两年菌株的型别差异较大。我们的研究发现某些ST型别与头孢曲松MIC值有较强的对应关系,如ST568,ST270,ST1766,属于这些型别的大部分菌株头孢曲松MIC值集中于特定范围内。这样的对应关系对于追踪特殊菌株(如耐药菌株)的传播有着重要意义,我们可以在某一特定区域内建立菌株型别数据库,一旦出现特殊菌株,通过和本地区数据库进行比对,从而对其溯源。另外,在特定区域内,利用头孢曲松MIC和ST型别之间的对应关系,直接在临床开展分子分型研究,从而快速判别其头孢曲松MIC值的大致范围是非常有意义的,但这需要建立起较为庞大的数据库,以提高其准确性。

在本研究的NG-MAST分型实验中,分离出166个型别,说明南京市淋球菌的多样性,而且其中有93种新型别,可能与NG-MAST数据库中缺少中国地区相关数据有关,为此,我们将所有新型别上传至NG-MAST数据库,以丰富该数据库中中国地区淋球菌型别的数据。2007—2012年菌株之间优势型别的差异表明,2007—2012年间南京市的淋球菌型别构成有很大的变化,说明了时间上的跨度较大,该地区性网络发生了波动。

[1] 苏晓红.淋球菌对广谱头孢菌素的耐药性及应对策略[J].中华皮肤科杂志，2013，46(5):301-304.

[2]Ohnishi M，Golparian D，Shimuta K，et al.IsNeisseria gonorrhoeaeinitiating a future era of untreatable gonorrhea?:detailed characterization ofthefirststrain with high-level resistance to ceftriaxone[J].Antimicrob Agents Chemother，2011，55(7):3538-3545.

[3]Unemo M，Golparian D，Nicholas R，et al.High-level cefiximeand ceftriaxone-resistantNeisseria gonorrhoeaein France:novel penA mosaic allele in a successful international clone causes treatment failure[J].Antimicrob Agents Chemother，2012，56(3):1273-1280.

[4]Camara J，Serra J，Ayats J，et al.Molecular characterization of two high-level ceftriaxone-resistantNeisseria gonorrhoeaeisolates detected in Catalonia，Spain[J].J Antimicrob Chemother，2012，67(8):1858-1860.

[5]Ison CA，Hussey J，Sankar KN，et al.Gonorrhoea treatment failures to cefixime and azithromycin in England，2010[J].Euro Surveill，2011，16(14):19833.

[6]Unemo M，Golparian D，Hestner A.Ceftriaxone treatment failure of pharyngeal gonorrhoea verified by international recommendations，Sweden，July 2010[J].Euro Surveill，2011，16(6):19792.

[7]Unemo M，Golparian D，Syversen G，et al.Two cases of verified clinical failures using internationally recommended first-line cefixime for gonorrhoea treatment，Norway，2010[J].Euro Surveill，2010，15(47):19721.

[8]Heymans R，Bruisten SM，Golparian D，et al.Clonally relatedNeisseria gonorrhoeaeisolates with decreased susceptibility to the extended-spectrum cephalosporin cefotaxime in Amsterdam，the Netherlands[J].Antimicrob Agents Chemother，2012，56(3):1516-1522.

[9]Tapsall J，Read P，Carmody C，et al.Two cases of failed ceftriaxone treatmentin pharyngealgonorrhoea verified by molecular microbiological methods[J].J Med Microbiol，2009，58(Pt 5):683-687.

[10]Yokoi S，Deguchi T，Ozawa T，et al.Threat to cefixime treatment for gonorrhea[J].Emerg Infect Dis，2007，13(8):1275-1277.

[11]Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI).Performance standards for antimicrobial susceptibility testing:twenty-first informational supplement[M].Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)，2011.

[12]Martin IM，Ison CA，Aanensen DM，et al.Rapid sequence-based identification of gonococcal transmission clusters in a large metropolitan area[J].J Infect Dis，2004，189(8):1497-1505.

[13]Su XH，Jiang FX，Dai XQ，et al.Surveillance of antimicrobial susceptibilities inNeisseria gonorrhoeaein Nanjing，China，1999-2006[J].Sex Transm Dis，2007，34(12):995-999.

[14]Ye SZ.Survey on antibiotic sensitivity ofNeisseria gonorrhoeaestrains isolated in China，1987-1992[J].Sex Transm Dis，1994，21(4):237-240.

2013-04-25)

(本文编辑：吴晓初)

Ceftriaxone susceptibility testing and multi-antigen sequence typing ofNeisseria gonorrhoeaestrains isolated in 2007 and 2012 from Nanjing,China

Chen Shaochun，Yin Yueping，Dai Xiuqin，Sun Houhua，Yu Ruixing，

Han Yan，Chen Xiangsheng.Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College;National Center for Sexually Transmitted Disease Control，China Center for Disease Control and Prevention，Nanjing 210042，China

Yin Yueping，Email:yinyp@ncstdlc.org

ObjectiveTo test the ceftriaxone susceptibility ofNeisseria gonorrhoeae(NG)isolates from Nanjing city，and to assess their genotypes by using the NG multi-antigen sequence typing(NG-MAST)method.MethodsA total of 204 NG strains isolated in 2007 and 81 in 2012 from Nanjing city were included in this study.The minimum inhibitory concentration(MIC)of ceftriaxone was determined for these strains using an agar dilution method.DNA was extracted by the Qiagen commercial kit from these strains followed by NG-MAST.Results All the isolates were susceptible to ceftriaxone(MIC，≤ 0.25 μg/ml).The MIC of ceftriaxone was ≥ 0.06 μg/ml for 63.2%of all the NG strains，70.6%of those isolated in 2007 and 44.4%of those in 2012，and ≥ 0.125 μg/ml for 31.6%of all the NG strains，39.7%of those isolated in 2007，11.1%of those in 2012.Totally，166 genotypes were identified among the 285 isolates，of which，73 had been reported，and 93 were previously unreported.The most prevalent genotype was ST568(n=13)in NG strains isolated in 2007，followed by ST270(n=9)，ST421(n=7)，ST2288(n=5)，ST1731(n=4)，ST1766(n=4)，ST1866(n=4)，ST1870(n=4)，while ST2318(n=5)，ST1053(n=4)，ST5990(n=4)，ST8726(n=4)were the common genotypes in 2012.Those isolates with identical or similar genotypes tended to display similar MICs for ceftriaxone.ConclusionsThe prevalent genotypes of NG are markedly different between 2007 and 2012 in Nanjing region，and there is a strong association between the genotypes and ceftriaxone susceptibility of NG.NG-MAST results may serve as a genetic marker in the surveillance of antibiotic susceptibility in NG.

Neisseria gonorrhoeae;Drug resistance;Ceftriaxone

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.05.003

国家自然科学基金青年科学基金(81101294);协和青年基金(3332013143)

210042南京,中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所、中国疾病预防控制中心性病控制中心

尹跃平,Email：yinyp@ncstdlc.org