逍遥散对阿尔茨海默病模型大鼠海马CA1区及前额叶超微结构的影响

赵唯贤 郭梅珍 王保伟 刘建涛 李高申 李宜培 刘俊玲

(河南医学高等专科学校，河南 郑州 451141)

阿尔茨海默病(AD)早期常表现为典型的抑郁症状和对日常兴趣的丧失，记忆力减退，智力下降，意念消极，性格改变等〔1，2〕。本研究从疏肝立法，通过对大鼠海马及前额叶超微结构的观察，探讨疏肝理气方剂对改善AD病指标的相关性，旨在为AD临床提供治疗依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级4～5个月SD雄性大鼠，体质量(250±20)g，河南省实验动物中心提供，合格证号:SCXX(豫)2010-0002。

1.1.2 干预药物

1.1.2.1 中药制备 逍遥散(组成:柴胡、当归、白芍、茯苓、炙甘草、生姜、薄荷)各药间质量按 10 ∶10 ∶10 ∶10 ∶5 ∶1 ∶1配比，由我院科研处按中药煎剂制备流程自行制作。于每日用药前2 h开始即时配制，最后将药液浓缩至2 g/ml，备用。

1.1.2.2 西药制备 将奥拉西坦药粉(石药集团欧意药业有限公司提供，400 mg/粒，批号:05110703)在每日用药前30 min用常温蒸馏水稀释成浓度为150 mg/ml的奥拉西坦溶液，备用。

1.1.3 试剂设备 D-半乳糖 (D-gal，Genview公司产，北京鼎国昌盛生物技术有限公司分装，批号:22L10133);β淀粉样多肽 (Aβ)1～42peptide(北京博奥森生物技术有限公司提供，批号:990901);洁净工作台 (上海博迅实业有限公司医疗设备厂);大脑立体定位仪 (安徽淮北正华单臂立体定位仪);超薄切片机 (型号 LKBV)、透射电镜 (日本电子，JEM-1400)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 适应性喂养3 d，6只/笼，光照节律12L∶12D(6∶00 ～18∶00)，室温 22℃ ～24℃，湿度 30% ～ 40%，自由饮水进食。喂以普通大鼠颗粒饲料(河南省实验动物中心提供)。使用苦味酸染色对每只大鼠进行标号。通过水迷宫实验，留用成绩最优者作为正式实验用大鼠，并随机分为生理组、模型组、西药组、中药组，每组10只。

1.2.2 试剂配制 ①事先将1 mg Aβ1～42加入200 μl生理盐水(5 μg/ul)，震荡混匀使其充分溶解，用封口膜密封，放入37℃温箱孵育1 w，孵育后可放入4℃冰箱保存备用;②D-gal用生理盐水稀释成10 g/L溶液，在使用前30 min临时配制。

1.2.3 模型制作 模型、西药、中药三组采用D-gal腹腔注射和 Aβ1～42peptide双侧海马注射联合造模〔3〕:大鼠经10%水合氯醛 (0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉，固定在大脑立体定位仪上，剪短头部毛发，切开头皮暴露头骨。以前囟为基点，将微量注射器针头对准前囟中央，针头后移4 mm，左右各移2 mm分别为左右侧海马位置。钻开头骨，用微量注射器针头进入大脑1.6 mm到达海马组织。每侧海马组织在10 min内缓慢注射10 μg(2 μl)孵育好的A-B溶液，每侧注射后将针头留置10 min，以免溶液外溢。注射完毕用骨蜡封闭针孔，缝皮、消毒，腹腔注射20万IU青霉素以防感染。生理组仅用等体积灭菌生理盐水如前各组操作象征性造模。

1.2.4 药物干预 各组均在造模完成后的次日开始。生理、模型组分别采用生理盐水0.5 ml/100 g灌胃;西药、中药组分别采用奥拉西坦溶液和逍遥散煎剂灌胃，剂量均为0.5 ml/100 g。四组均连续灌胃干预28 d，灌胃1次/d。

1.2.5 标本取材 干预结束后，大鼠以0.4 ml/100 g 10%水合氯醛麻醉液腹腔注射麻醉，断头处死，在滴有4℃ 4%戊二醛固定液的蜡板上 (蜡板放置在冰盒上)，迅速用刀片从正中剖开大脑，取出海马CA1区及前额叶组织，同时用注射器抽取4℃ 4%戊二醛固定液反复冲洗分离的组织1～2 min，使其固定，再迅速切成1 mm×1 mm×1 mm的小块，分组标记，放入装有4℃ 4%戊二醛固定液的小玻璃容器中，4℃保存、待检。

2 结果

电镜图片显示:生理组大鼠前额叶皮质(PFC)神经元细胞核居中，核仁明显，粗面内质网在胞质聚集成片，微管、微丝排列整齐，模型组大鼠PFC神经元可见大量线粒体肿胀、其嵴消失，粗面内质网扩张，核膜皱褶，微管、微丝排列紊乱、缠结;突触间隙明显变宽、突触后膜致密物(PSD)厚度明显变薄。中药组及西药组大鼠PFC神经元微量线粒体肿胀，少量粗面内质网扩张，微管、微丝排列较有序。与模型组大鼠比较，中药组大鼠PFC神经元突触间隙明显变窄、PSD厚度明显变厚。见图1。

图1 电镜观察各组海马CA1区、额叶区超微结构

3 讨论

AD的病理学特征是在脑内形成神经原纤维缠结和大量的老年斑等，神经原纤维缠结的主要成分是异常过度磷酸化的微管相关蛋白tau，老年斑的主要成分是Aβ〔4〕。在老年斑形成之前，有神经毒性的可溶性Aβ寡聚体可造成脑内突触损害〔5〕。线粒体等细胞器及突触等超微结构变化也是AD认知功能障碍的重要病理结构基础〔6～8〕。

正常情况下Aβ的产生和降解保持平衡，其从可溶状态到不溶状态的转变是AD发病的关键。Aβ的分子构型与Aβ神经毒性关系密切，β片层结构可促进Aβ聚集成不溶性纤维，形成极难溶的沉淀(斑块)，导致AD发生〔9〕。

学习记忆过程涉及多个脑区的功能活动，在人类，PFC与情绪之间有密切关系，临床和神经成像研究结果显示，PFC损伤对情绪行为会造成一定的影响〔10〕。PFC是大脑新皮质中起重要联络作用的一个区域，参与了学习和记忆的过程〔11〕。有学者推测PFC在前瞻性记忆的编码、保持、提取和执行的过程中可能起着重要作用〔12〕。有研究显示，小鼠模型学习记忆能力下降同时出现海马CA1区突触前后膜不清晰，间隙消失，小泡数目减少，部分线粒体肿胀变性，嵴断裂，推测这些超微结构的变化可能是早期学习记忆行为障碍的形态结构基础之一〔13〕。

本研究显示，逍遥散对AD模型大鼠CA1区及PFC神经元损伤的线粒体、粗面内质网，微管、微丝的排列紊乱有一定的调整作用，能降低AD模型脑内Aβ水平，进而减低了Aβ对大鼠海马的毒性作用。文献〔14〕报道，突触间隙变窄，PSD变厚等均能增强突触传递效能。逍遥散能使AD模型大鼠突触间隙变窄，PSD厚度变厚，增强突触传递效能，改善AD模型大鼠受损的学习记忆能力。

AD属中医的“呆病”、“郁证”范畴，中医对其病因有独特的理论，认为是一种全身性疾病，病位在脑，但与五脏具有关系，其中肾、脾、心、肝四脏关系最为密切。七情失调是本病形成的重要原因，当今社会中如精神创伤，情绪压抑;或独身居住、子女不孝;或离异丧偶、孤独寂寞等都可作为现场情志失调的重要因素。而肝主疏泄，调畅情志，对情志的调节作用至关重要。早期AD常表现为典型抑郁症状和对日常活动的兴趣丧失。AD的发病率逐年上升，严重危害老年人的身心健康和生活质量，并给家庭和社会带来沉重的负担，已成为严重的社会问题，应引起政府和医学界的高度关注，加强这方面的研究。

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