流通池法测定替硝唑阴道泡腾片的溶出度

李茜茜，邹玲玲，黄雪丽，冯 芳，2#（.中国药科大学药物分析教研室，南京 20009；2.江苏药物质量与安全预警教育部重点实验室，南京 20009）

替硝唑阴道泡腾片是一种特殊的新型制剂，主要用于治疗滴虫性阴道炎[1]。该药在阴道中崩解、释放，直接作用于病变部位发挥药效，具有起效快、生物利用度高、不良反应小、高度靶向等特点。由于用药部位的特殊性，采用传统的溶出度测定方法（如转篮法、桨法及小杯法）无法模拟药物在体内的溶出环境，因此建立适宜的体外溶出分析方法，对于考察研发制剂与参比制剂的一致性，研究仿制药物的制剂工艺，进行质量控制十分必要。

流通池法是一种新型溶出度测定方法，为《美国药典》（36版）和《欧洲药典》（8版）收载的溶出测定第4法。其采用开放体系测定方式，待测样品可在连续更新的介质环境中溶出，流速为1.5～35ml/min，适用于特殊剂型（如阴道用药相关剂型）的制剂工艺研究[2]。为此，在本研究中笔者采用流通池法，观察了溶出介质、溶出液流速及取样时间等因素对替硝唑阴道泡腾片溶出度的影响，绘制研发制剂与参比制剂的溶出曲线，比较相似因子和分析威布尔参数，从而评价两种制剂的一致性。

1 材料

CE7smart溶出仪（瑞士SOTAX公司）；SHZ-Ⅲ循环水式真空泵（南京科尔仪器设备有限公司）；UV-3100扫描型紫外-可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；pH计（上海雷磁仪器厂）；Libror AEC-210电子天平（日本岛津公司）。

替硝唑原料药（A制药公司，质量分数：100.4%）；空白辅料（A制药公司）；替硝唑阴道泡腾片（参比制剂，四川百利药业有限责任公司，批号：110301，规格：0.2g/片）；替硝唑阴道泡腾片（研发制剂，A制药公司，批号：110401、110402、110403，规格：0.2g/片）；磷酸二氢钠和柠檬酸均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 溶出介质的制备 甲溶液：取柠檬酸21g或无水柠檬酸19.2g，加水溶解成1000ml，置冰箱中保存。乙溶液：取磷酸二氢钠71.63g，加水溶解成1000ml。取上述甲溶液61.45 ml和乙溶液38.55ml混合，摇匀，即得柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液（pH4.0）。

2.1.2 对照品贮备液的制备 精密称取替硝唑原料药20.00 mg，共两份，分别置于不同的100ml量瓶中，分别加水和柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液定容，摇匀，制成质量浓度均为200μg/ml的对照品贮备液A和B。

2.1.3 空白对照贮备液的制备 精密称取空白辅料40.00mg，共两份，分别置于不同的100ml量瓶中，分别加水和柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液定容，摇匀，制成空白对照贮备液A和B。

2.1.4 模拟处方贮备液的制备 精密称取含替硝唑原料药20.00mg和空白辅料40.00mg的模拟处方两份，分别置于不同的100ml量瓶中，分别加水和柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液定容，摇匀，制成替硝唑质量浓度均为200μg/ml的模拟处方贮备液A和B。

2.1.5 供试品溶液的制备 流通池仪器自动取样装置分别于不同取样点收集溶出液10ml，经0.45μm的水性滤膜滤过后，分别加水和柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液稀释不同倍数（吸光度A为0.3～0.7），摇匀，即得。

2.2 溶出度测定方法

采用开放式流通池法，将替硝唑阴道泡腾片置于锥形部装满1mm玻璃珠的流通池内，分别以脱气处理的水和柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液为溶出介质，在流通池内以层流方式流动，温度为37℃。流速为3ml/min时，于2、4、8、10、15、20、30、45、60min收集溶出液；流速为2ml/min时，于2、4、8、10、15、20、30、45、60、90min收集溶出液。溶出液经0.45μm水性滤膜滤过后稀释，采用紫外-可见分光光度法在315nm波长处测定吸光度。

2.3 专属性试验

取“2.1.2”项下对照品贮备液A和B各3ml，分别置于不同的50ml量瓶中，分别加水和柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液定容，得替硝唑质量浓度均为12μg/ml的两种对照品溶液；取“2.1.4”项下模拟处方贮备液A和B各3ml，分别置于不同的50ml量瓶中，分别加水和柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液定容，得替硝唑质量浓度均为12μg/ml的两种模拟处方溶液；取“2.1.3”项下空白对照贮备液A和B各3ml，分别置于不同的50ml量瓶中，分别加水和柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液定容，得两种空白对照溶液。取上述各溶液约3ml，置于不同的比色皿中进行紫外扫描，光谱详见图1。由图1可见，空白对照在315nm波长及附近无紫外吸收，说明替硝唑阴道泡腾片在315nm波长处的溶出曲线专属性良好。

2.4 模拟处方溶液滤膜吸附性试验

取“2.1.4”项下模拟处方贮备液A 1、3、5ml，分别置于不同的50ml量瓶中，加水定容，得替硝唑质量浓度分别为4、12、20μg/ml的模拟处方溶液Ⅰ；取“2.1.4”项下模拟处方贮备液B 1、3、5ml，分别置于不同的50ml量瓶中，加柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液定容，得替硝唑质量浓度分别为4、12、20μg/ml的模拟处方溶液Ⅱ，各浓度平行3份。计算两种模拟处方溶液未滤过、弃去滤液1ml、弃去滤液3ml后的吸光度差异，结果见表1。

2.5 溶出液滤膜吸附性试验

在3ml/min流速下，分别取参比制剂（批号：110301）与研发制剂（批号：110401）在水和柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液中于8、15、45min时的溶出液。参比制剂与研发制剂均分别考察2次（即参比制剂110301-1与参比制剂110301-2，研发制剂110401-1与研发制剂110401-2）。计算在两种介质中不同时间点的溶出液未滤过、弃去滤液1ml、弃去滤液3ml后的吸光度差异，结果见表2。

表1 模拟处方溶液滤膜吸附性试验（n＝3）Tab 1 Membrane adsorption test of simulated prescription solution（n＝3）

表2 溶出液滤膜吸附性试验Tab 2 Membrane adsorption test of dissolution fluid

2.6 线性关系考察

文献报道，紫外分光光度法测定替硝唑的线性范围约2～24μg/ml[3-5]。取“2.1.2”项下对照品贮备液A 1、1.5、2、3、4、5 ml，分别置于不同的50ml量瓶中，加水定容，制成质量浓度为4、6、8、12、16、20μg/ml的标准曲线溶液Ⅰ；取“2.1.2”项下对照品贮备液B 1、1.5、2、3、4、5ml，分别置于不同的50ml量瓶中，加柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液定容，制成质量浓度为4、6、8、12、16、20μg/ml的标准曲线溶液Ⅱ。测定上述两种标准曲线溶液的吸光度，以质量浓度（x）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标，进行线性回归，得替硝唑在水为溶出介质时的回归方程y＝0.0365x－0.0004（r＝0.9999）；在柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液为溶出介质时的回归方程y＝0.0358x－0.0014（r＝0.9999）。结果表明，替硝唑检测质量浓度在4～20µg/ml范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.7 精密度试验

取“2.4”项下两种模拟处方溶液，各浓度平行3份，进行紫外扫描测定吸光度。结果，以水为溶出介质时，RSD分别为0.58%、0.20%、0.07%；以柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液为溶出介质时，RSD分别为0.38%，0.44%，0.18%。表明本法精密度良好。

2.8 稳定性试验

取“2.1.2”项下对照品贮备液A 1、3、5ml，分别置于不同的50ml量瓶中，加水定容，制成替硝唑质量浓度分别为4、12、20μg/ml的对照品溶液Ⅰ；取“2.1.2”项下对照品贮备液B 1、3、5ml，分别置于不同的50ml量瓶中，加柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液定容，制成替硝唑质量浓度分别为4、12、20μg/ml的对照品溶液Ⅱ，各浓度平行3份。取上述两种对照品溶液和“2.4”项下两种模拟处方溶液，于室温放置0、2、4、8、12h时测定其吸光度，结果见表3。由表3可见，对照品溶液和模拟处方溶液在12h内质量稳定。

表3 稳定性试验（n＝3）Tab 3 Stability test（n＝3）

2.9 溶出度测定

取参比制剂（批号：110301）与研发制剂（批号：110401、110402、110403）适量，分别加水和柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液，取在2ml/min与3ml/min流速下不同取样时间点的溶出液，按“2.1.5”项下方法制备供试品溶液，采用紫外-可见分光光度法测定吸光度，计算累积溶出百分率，结果见表4。

表4 替硝唑阴道泡腾片累积溶出百分率（%，n＝6）Tab 4 Cumulative dissolution percentage of Tinidazole vaginal effervescent tablets（%，n＝6）

2.10 体外溶出数据分析

采用相似因子比较及威布尔参数分析，比较研发制剂与参比制剂溶出行为的相似性。

2.10.1 相似因子比较 溶出曲线相似性的评价方法曾有多种，但自1999年美国食品与药品管理局推荐采用f2相似因子比较法以来，该法已被普遍采用[6]。通过计算f2予以判断，f2值的范围在0～100，f2值越大，两条曲线的相似性越高，f2值大于50即可判定为相似[6]。在本研究中，笔者比较了参比制剂（批号：110301）与研发制剂（批号：110401、110402、110403）在2 ml/min和3ml/min两种流速下，在水和柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液两种介质中的溶出曲线差异，并且计算相似因子f2。依照相似因子计算的一般规则，选择溶出间隔相近的时间点进行比较。流速为3ml/min时，2、4、8、15min 4个时间点的溶出百分率均为20%左右，因此选择以上4个点对参比制剂与研发制剂进行比较。流速为2ml/min时，2、4、8、10、15min 5个时间点的溶出百分率均在10%～15%，因此选择以上5个点对上述制剂进行比较。根据f2相似因子的计算公式[7]：参比制剂平均累积溶出百分率，Ti：研发制剂平均累积溶出百分率），结果f2均大于50，表明研发制剂与参比制剂的溶出曲线相似，详见表5。

表5 相似因子f2计算结果Tab 5 f2 values of the similarity factor

2.10.2 威布尔参数分析 威布尔方程既能反映制剂工艺情况、工艺的内在差异，又能反映制剂的溶出快慢情况[8]，与相似因子结果相互补充，可更加全面地比较研发制剂与参比制剂的相似程度。笔者利用威布尔分布模型提取溶出参数进行统计学分析。根据威布尔分布函数导出威布尔分布函数表达式：ln用此公式拟合药物溶出曲线方程，并计算特征溶出参数T50（药物溶出50%所需时间）和Td（药物溶出63.2%所需时间）。在不同流速下，分别将研发制剂（批号：110401、110402、110403）的T50和Td与参比制剂（批号：110301）的T50和Td进行统计学分析。结果表明，研发制剂溶出参数与参比制剂的差异无统计学意义（P＞0.05），详见表6。

表6 威布尔参数计算结果Tab 6 The results of Weibull distribution parameters

3 讨论

3.1 检测波长的选择

替硝唑结构中含有硝基咪唑基团，具有较强的紫外吸收，在水和柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液中的最大吸收波长均为315nm，而空白辅料在此波长处无吸收，因此采用紫外-可见分光光度法对替硝唑阴道泡腾片的溶出度进行测定。

3.2 溶出介质的选择

《日本医疗用药品品质情报集》（橙皮书）中替硝唑片剂溶出曲线的测定是采用水和pH分别为1.2、4.0、6.8的缓冲液为溶出介质[10]。考虑到替硝唑阴道泡腾片用药部位的特殊性，参照文献报道阴道内的pH为3.8～5[11-12]，故最终选择水和pH 4.0的缓冲液作为溶出介质。

3.3 流速及取样时间点的选择

通常流通池法测定时，选择流速 16、8、4ml/min[2，13]。考虑到替硝唑阴道泡腾片特殊的使用环境（蠕动较慢），试验中首先在4ml/min流速下，取样时间点为5、15、30、60、90min和2、3、4、5、6h时，考察其溶出行为。结果显示，在此条件下替硝唑阴道泡腾片的溶出速度很快，5min时累积溶出百分率达50%，60min以后替硝唑溶出几近完全。故将4ml/min流速时取样时间点调整为2、4、8、10、15、20、30、45、60min。进一步降低流速，在3，2、1.5ml/min流速条件下分别测定。结果发现，3ml/min流速下，替硝唑60min时的溶出基本完成，而2 ml/min和1.5ml/min流速下，60min时替硝唑的溶出尚未完全，因此后两个流速条件下取样时间点延长至90min。不同流速下的替硝唑阴道泡腾片累积溶出曲线详见图2（批号：110402，介质：水）。

图2 不同流速下的替硝唑阴道泡腾片累积溶出曲线Fig 2 Cumulative dissolution profiles of Tinidazole vaginal effervescent tablet at different flow rates

由图2可见，流速为4ml/min和3ml/min时溶出行为相似；流速为2ml/min和1.5ml/min时，溶出速度减缓，尤其是后者在90min时，累积溶出百分率仍小于75%。为了充分比较参比制剂与研发制剂溶出行为的异同，最终确定3ml/min和2 ml/min作为试验用流速，取样时间分别为2、4、8、10、15、20、30、45、60min和2、4、8、10、15、20、30、45、60、90min。

综上所述，笔者建立的方法简单、快速，可用于替硝唑阴道泡腾片溶出度的测定。

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