桑叶多糖对糖尿病肾病大鼠肾脏纤维化的影响

刘洪凤 韩智学 聂 影 金龙云 王桂云 岳 辉 李 齐 薛继婷 申梅淑

(牡丹江医学院生物化学教研室，黑龙江 牡丹江 157011)

糖尿病肾病(DN)已成为导致慢性肾衰竭的首位病因，肾脏纤维化是各种原因肾脏疾病进展到慢性肾衰竭的共同途径和主要病理基础。在肾脏纤维化形成的发病机制中，细胞因子网络始终是人们的研究热点，组织转化生长因子β1(TGF-β1)是目前公认的致纤维化最强的细胞因子〔1〕，针对TGF-β1的研究已成为治疗DN的一个新的靶标。桑叶多糖(MLP)是桑叶的主要活性成分之一，具有降糖降脂、强心降压、降低胰岛素抵抗等多种药理功效〔2～4〕。但是从分子水平研究MLP对DN大鼠TGF-β1基因表达的影响还未见有报道。本实验探讨MLP对DN大鼠的肾脏纤维化的干预作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 健康雄性Wistar大鼠100只，体重(220±50)g。MLP(南京泽朗医药科技有限公司);链脲佐菌素(STZ)(Sigma公司);PCR引物(上海博亚生物技术有限公司合成)。

1.2 大鼠模型的制备及分组 清洁级Wistar大鼠随机分为A组15只和造模组85只。造模方法:动物适应性喂养1 w后，禁食12 h，将STZ按65 mg/kg一次性(ip)给药制备糖尿病大鼠模型。造模后每日检测血糖、尿糖，连续3 d空腹血糖值 ＞16.7 mmol/L、尿糖定性⧺以上、尿量增加1倍以上为糖尿病模型形成。再继续喂养1 w，随机抽取两只动物测尿 mAlb，mAlb＞15 μg/ml，确定DN模型形成。取造模成功的DN大鼠60只随机分为 B组、C组、D组、E组，每组15只，余者弃掉。各组大鼠分别给以下处理:A组、B组大鼠2 ml·kg－1·d－1腹腔注射生理盐水;C、D、E 治疗组大鼠2 ml·kg－1·d－1腹腔注射 MLP(0.4、0.2、0.1 g/ml)，治疗8 w后，取材后处死大鼠。

1.3 血、尿采集及生化检测 MLP给药治疗8 w末，股动脉穿刺取血，血糖仪检测空腹血糖(FPG)，两点法测定尿素氮(BUN)，苦味酸法测定血肌酐(Cr)，以考马斯亮蓝法检测微量白蛋白(mAlb)含量。

1.4 肾脏组织TGF-β1 mRNA水平检测 取肾皮质100 mg，加液氮研碎后，采用Trizol试剂提取总RNA，两步法RT-PCR反应检测TGF-β1mRNA PCR，以 β-actin为内参照。反应条件为:94℃5 min 1 个循环，94℃ 变性 50 s，60℃ 退火 45 s，72℃ 延伸45 s，35个循环后72℃延伸7 min。TGF-β1(405 bp)上游引物序列:5'-CGAGGTGACCTGGGCACCATCATGAC-3'，下游引物序列: 5'-CTGCTCCACCTTGGGCTTGCGACCCAC-3'; β-actin(240 bp)上游引物序列:5'-AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3'，下游引物序列:5'-TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3'。取PCR扩增产物5 μl在1.5%琼脂糖中电泳，结果用UVPDGS-8000型凝胶成像系统成像，并用密度扫描仪分析PCR产物条带，TGF-β1 mRNA表达水平以相对光密度表达量，即TGF-β1/β-actin 比率计算。1.5 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件，计量资料用s表示组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 大鼠FPG、BUN、Cr、mAlb变化 大鼠成模后出现代谢紊乱症状，并逐渐加重，体重下降。模型组FPG、BUN、Cr、mAlb高于A组(P＜0.01)。C、D 组 FPG、BUN、Cr、mAlb高于 B 组(P＜0.01)。见表1。

表1 各组大鼠的FPG、BUN、Cr、mAlb水平( s，n=15)

表1 各组大鼠的FPG、BUN、Cr、mAlb水平( s，n=15)

与A组比较:1)P＜0.01;与B组比较:2)P＜0.01

A组5.76±0.43 6.23±1.28 31.54±2.39 9.11±0.67 B组 23.96±0.321)6.31±1.311)65.68±11.851)85.57±2.941)C组12.75±0.511)2)6.26±1.231)2)42.24±15.971)2)30.51±2.731)2)D组16.95±0.581)2)6.28±1.211)2)50.32±14.721)2)59.43±3.521)2)E组20.29±0.371)2)6.29±1.251)2)63.87±13.361)2)71.68±5.661)2)

2.2 各组大鼠TGF-β mRNA表达的测定 C、D、E治疗组肾脏TGF-β1mRNA 表达分别为(0.91±0.13)、(0.98 ±0.16)、(1.21±0.11)较 DN大鼠 B组表达显著降低(1.23±0.09，P＜0.01)。B组肾脏 TGF-β1 mRNA较 A组明显增高(0.89±0.12，P ＜0.01)。

3 讨论

DN的主要病理变化特点包括肾小球肥大、肾小球细胞外基质(ECM)积聚、基底膜增厚以及肾小球纤维化，而ECM的过度积聚则是导致肾小球硬化发生和发展的基础〔5，6〕。TGF-β1被认为是DN中导致ECM积聚的重要因子。高血糖能促进TGF-β1表达上调，而过度表达的 TGF-β1能刺激ECM合成;ECM的合成增加或降解减少，均可引起ECM过度积聚，而ECM的过度积聚最终会导致肾小球的纤维化。本实验结果显示MLP可以显著降低DN大鼠的FPG，BUN、Cr及mAlb水平，说明MLP对DN大鼠肾脏有着良好的保护作用，其作用机制可能与MLP下调TGF-β1 mRNA表达有关。本研究结果为今后运用MLP治疗DN提供了实验依据，也为临床干预DN进展提供新的靶标。

1 Wu Y，Ren K，Liang C，et al.Renoprotective effect of total glucosides ofpaeony(TGP)and its mechanism in experimental diabetes〔J〕.J Pharmacol Sci，2009;109(1):78-87.

2 刘洪凤，任岩海，韩智学，等.桑叶多糖对糖尿病大鼠resistin mRNA表达的影响〔J〕·中国食物与营养，2012;18(4):67-8.

3 任岩海，刘洪凤，韩智学.桑叶多糖对2型糖尿病大鼠血糖血脂的影响〔J〕.中医药学报，2013;41(1):20-1.

4 任岩海，刘洪凤，宋铁军，等.2桑叶多糖对糖尿病大鼠 Resistin蛋白表达的影响〔J〕.中医 药信息，2012;29(6)22-3.

5 孙培荣，石永兵，施晓松.银杏达莫对梗阻性肾病大鼠肾间质纤维化中 TGF-β1表达的影响〔J〕.中国误诊学杂志，2010;26(9):6304-6.

6 Wang W，Huang XR，Canlas E，et al.Essential role of Smad3 in angiotensin Ⅱ-induced vascular fibrosis〔J〕.Circ Res，2009;98(8):1032-9.