复元胶囊对膝骨关节炎大鼠IL-1β、OPG和OPGL mRNA表达的影响

李 强 周国庆 邓紫婷 李荣亨 (重庆医科大学附属第一医院中西医结合科，重庆 400016)

骨保护素(OPG)/骨保护素配体(OPGL)的比值在破骨细胞的分化成熟中起到重要作用，参与调控软骨下骨的骨重塑过程。近期发现，在关节软骨中有OPGL与OPG的表达〔1〕，并从软骨细胞弥散到软骨下骨，与OA的形成及关节旁骨丢失相关联。白细胞介素(IL)-1可以通过影响RANKL-RANK相互作用机制调节破骨细胞的分化和功能。复元胶囊是经过长期临床验证，对骨关节炎(OA)有显著疗效的复方制剂，本实验通过Hulth法建立实验性OA大鼠模型，用复元胶囊进行治疗，与临床上常用于治疗OA的中成药抗骨增生胶囊对照，通过检测关节软骨中IL-1β、OPG和OPGL mRNA表达变化，探讨复元胶囊是否通过调节OPG与OPGL的平衡、降低IL-1的表达而达到缓解OA的损伤作用机制，并深入了解IL-1β与OPG和OPGL在OA中的相互作用关系。

1 材料与方法

1.1 材料 ①实验动物:健康成年雄性SD大鼠60只(重庆医科大学动物实验中心提供)，体重200～250 g。实验动物生产许可证号:SYXK(渝)2012-0001。②实验药物:复元胶囊(批准文号:渝卫2002〔42-33〕)由淫羊藿、鹿茸、黄芪、人参、枸杞子、川芎等组成，每粒胶囊重0.41 g相当于生药4.0 g，由重庆希尔安药业有限责任公司生产。抗骨增生胶囊，由江苏康缘药业股份有限公司生产，生产批号:110402。

1.2 方法 ①动物分组:60只雄性SD大鼠随机分为6组:正常组、模型组、抗骨增生胶囊组、复元胶囊高、中、低组，每组10只。②建立动物模型:随机选择50只大鼠，依照Hulth法造模〔2〕，0.035 g/kg水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，无菌条件下沿右侧膝关节内侧切开长约2 cm切口，暴露膝关节，切断前后交叉韧带及内侧副韧带，完整切除内侧半月板，逐层缝合关节腔，无菌包扎。术后每天肌注青霉素2×104U/kg，共1 w，余下10只作为正常组，1 w后，每天驱赶大鼠跑步30 min。③给药:根据Meeh-Rubner公式计算大鼠的给药剂量。手术后第2周复元胶囊组分别给予复元胶囊 2 229.90、743.30、371.65 mg·kg－1·d－1，抗骨增生胶囊组给予抗骨增生胶囊 557.00 mg·kg－1·d－1，分别配置成3 ml溶液灌胃。模型组给予每天等量生理盐水灌胃，正常组不予任何处理。连续12 w。

1.3 标本处理 按期处死大鼠，取大鼠右侧膝关节关节软骨及软骨下骨标本，置于4%多聚甲醛中固定，10%EDTA中脱钙，矢状位取材，常规脱水石蜡包埋，切片备用。

1.4 观察指标 ①大体观察关节软骨:在灌胃12 w时，处死各组大鼠，观察有无关节积液及滑膜肿胀，并于光学显微镜下观察膝关节软骨的情况，按Pelletier-JP标准进行评分。评分标准:0分:关节面透明光整，色泽正常;1分:关节面粗糙，有裂隙，色泽灰暗;2分:关节面糜烂，软骨缺损深达软骨表层和中层;3分:关节面溃疡形成，缺损深达软骨深层;4分:软骨剥脱，软骨下骨暴露。②光镜观察软骨细胞及基质:切片进行HE染色，显微镜下观察关节软骨的结构、细胞数量及潮线的完整性。参照Mankin等〔3〕法的关节软骨病理评分标准进行积分统计。③RT-PCR法检测软骨中 IL-1β、OPG、OPGL mRNA的表达:取损伤区关节软骨在液氮中研磨成粉末，按照说明书操作提取总RNA，紫外分光光度仪检测样品吸光度(A)，A260/280在1.8～2.0之间。应用RT-PCR法检测标本中IL-1β、OPG、OPGL mRNA的表达。其中 IL-1β引物序列:①上游:5'TCTGTGACTCGTGGGATGAT3';②下游:5'CTTCTTTGGGTATTGTTTGG 3';反应条件:变性94℃ 30 s，退火55.4℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，共30个循环，72℃延伸5 min。OPG引物序列:①上游:5'TGCTCCTGGCACCTACCTAA 3';② 下 游:5'TCACCTGAGAAGAACCCATCC 3';反应条件:变性 94℃ 30 s，退火58.7℃ 30 s，延伸 72℃ 30 s，共 30 个循环，72℃ 延伸 5 min。OPGL引物序列:①上游:5'TACAGGTTTGCAGGACTCGAC 3';②下游:5'AGGACAGACTGACTTTATGGGAA 3';反应条件:变性94℃ 30 s，退火57.6℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，共30个循环，72℃延伸5 min。GAPDH引物序列:①上游:5'GTGCTGAGTATGTCGTGGAGTCT3';②下游:5'GTGGAAGAATGGGAGTTGCTGT 3';反应条件:变性 94℃ 30 s，退火 58.5℃ 30 s，延伸72℃ 45 s，共30个循环，72℃延伸5 min。反应产物用3%琼脂糖凝胶电泳(80 mV，30 min)，采用凝胶成像系统扫描和分析扩增带，与内参GAPDH比较，得到相对表达强度。

1.5 统计学方法 采用SPSS11.0软件，计量资料以s表示，多组均数间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和两两比较(LSD法)，等级资料采用多组单向有序资料的Ridit分析，计算合并方差，并进行统计学两两检验。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况 造模过程动物无死亡，术后无感染，健康状况良好，术后模型组及治疗组，局部刺激有疼痛反应，患肢收缩痉挛，后肢跛行明显，蹬地力量减弱，伴有关节不稳，有异常活动度，1 w后消失，4 w后关节畸形肿大，正常组关节外部结构正常，无肿胀，活动自如。

2.2 大体形态观察 正常组关节面平整光滑、呈淡蓝色、色泽明亮、无裂纹及软化、滑膜无增生、关节液清凉透明。模型组病理改变明显，软骨面糜烂、颜色灰暗、失去光泽、软骨边缘增生明显、多数标本可见大小不等的溃疡、并深达骨质、软骨下骨暴露，滑膜不同程度增生粘连、关节液增多、混浊。复元胶囊高、中剂量组及抗骨增生组软骨面稍粗糙、颜色淡黄、软骨边缘有增生、部分有裂纹及小溃疡出现、滑膜可见少许增生、关节液略增多。各组膝关节软骨退化评分见表1。

2.3 光镜观察 正常组关节软骨四层结构清楚、软骨表层光滑平整、各层细胞排列整齐、潮线清晰;模型组软骨层变薄、表层有裂隙、细胞数目变少紊乱、潮线严重断裂模糊;抗骨增生组软骨表面欠平整、细胞层数增多、排列稍紊乱、潮线断裂呈双层;复元低剂量组表层裂隙形成、细胞排列紊乱、陷窝出现空泡样变、潮线紊乱;复元中剂量组、细胞层增生、细胞数目增多;复元高剂量组表层平整、细胞略有增生、中层有少量细胞簇聚、可见双重潮线。见图1，Mankin评分见表2。

表1 各组膝关节软骨退变程度分级(n，n=10)

图1 各组关节软骨光镜观察结果(HE，×200)

2.4 关节软骨中IL-1β、OPG、OPGL mRNA的表达结果 与正常组相比，模型组软骨细胞中IL-1β、OPG和OPGL mRNA的表达含量均显著增高(P＜0.01)，复元胶囊治疗组及抗骨增生胶囊治疗组 OPG mRNA表达含量明显增高(P＜0.05)，IL-1β mRNA、OPGL mRNA的表达含量明显降低(P＜0.05)，OPG与OPGL的比值在复元胶囊高剂量组与中剂量组中增高(P＜0.05)。见表2，图2。

表2 各组大鼠膝关节软骨中Mankin评分、IL-1β、OPG、OPGL mRNA的表达及OPG/OPGL比值变化( s，n=10)

表2 各组大鼠膝关节软骨中Mankin评分、IL-1β、OPG、OPGL mRNA的表达及OPG/OPGL比值变化( s，n=10)

与正常组比较:1)P＜0.01，2)P＜0.05;与模型组比较:3)P ＜0.01，4)P ＜0.05

OPG OPGL OPG/OPGL复元高剂量组 4.8±0.631)3) 0.52±0.062)3) 1.15±0.121)3) 1.06±0.193) 1.12±0.311)3)组别 Mankin评分 IL-1β 4±0.18复元中剂量组 5.70±0.951)3) 0.83±0.121)3) 1.20±0.031)3) 1.33±0.47 0.97±0.301)3)复元低剂量组 7.9±0.991)4) 0.89±0.141)3) 0.79±0.091)3) 1.59±0.592) 0.55±0.20抗骨增生组 5.9±0.741)3) 0.82±0.111)3) 1.06±0.051)3) 1.23±0.324) 0.51±0.28模型组 8.80±0.631) 1.27±0.081) 0.58±0.051) 1.75±0.371) 0.34±0.11正常组 0.50±0.53 0.42±0.07 0.46±0.04 1.05±0.26 0.4

图2 各组大鼠关节软骨组织IL-1β、OPG、OPGL mRNA琼脂糖凝胶电泳图

3 讨论

OA发病机制与软骨细胞退变，软骨下骨重塑等有重要关系。OPG/OPGL/RANK系统是联系软骨与软骨下骨的一条关键路径，OPG与OPGL的平衡对软骨下骨的重塑起到决定性的作用。OPG与OPGL均可由软骨细胞分泌，当膜分泌蛋白型OPGL与破骨细胞前体表面的RANK结合后，介导破骨细胞前体转换成成熟的破骨细胞，破骨细胞的活化促进骨的重吸收，而OPG可竞争性结合OPGL，抑制骨的重吸收。已经证明体内多种作用于破骨细胞的细胞因子都是通过改变OPG/OPGL的比率实现的〔4〕。

IL-1β是OA中一个关键性的炎症因子，可以通过多条路径诱导关节软骨细胞过早衰老〔5〕，提示IL-1β的升高程度与软骨的损伤程度呈正相关。Watanabe等〔6〕通过研究显示，IL-1β可以通过增加软骨细胞中OPG的表达含量抑制破骨细胞的生成。

本实验通过Hulth法建立实验动物模型，造模后1 w驱赶大鼠每天跑步30 min，在12 w时相当于OA的晚期〔7〕。关节大体及光镜评分中模型组比正常组显著增高，说明病变严重程度与积分高低呈正比，也提示本实验造模成功。模型组中RTPCR结果显示，OPG mRNA、IL-1β mRNA和OPGL mRNA的表达含量均显著增高，与Pilichou等〔8〕研究一致，OPG含量与OA严重程度成正比，这可能是软骨细胞受损做出的自我保护反应，也可以用Watanabe等〔6〕的研究结果解释，这与IL-1β的升高，刺激软骨细胞分泌OPG，抑制成熟破骨细胞的形成相关。本研究结果说明复元胶囊可以上调软骨组织中OPG mRNA的表达含量，下调IL-1β mRNA和OPGL mRNA的表达含量，阻止破骨细胞的成熟，抑制软骨下骨重吸收，防止骨侵蚀加重。

OA属于中医的痹证范畴，中医素有肾主骨的说法，《素问·痹论》中有“风寒湿三气杂至，合而为痹...故骨痹不已，复感于邪，内舍与肾。筋痹不已，复感于邪，内舍与肝”的说法，故痹证日久不愈，气血运行不畅，瘀血阻闭经络，正气耗伤，累及肝肾，因而此病具有“久病必虚，久病多瘀，久病累及肝肾”的病变特点，属于以肝肾亏虚为本，瘀血闭阻经络为实的本虚标实的证候，故应用补肝肾同时辅以活血化瘀的方法进行治疗。复元胶囊是由临床验方复原汤化裁而来，由淫羊藿、鹿茸、黄芪、人参、枸杞子、川芎等组成。本方具有补肝肾，滋养、濡润筋骨，使其“荣则不痛”。同时本方还具有活血化瘀，疏通经络，使其“通则不痛”，达到标本兼治的目的。而现代药理研究证明，补肾的中药及其中的单体成分如淫羊藿总黄酮、川芎嗪等能够调节OPG/OPGL的比值保护骨组织〔9～11〕，而一些益气活血的中药及单体能够抑制IL-1β的表达〔12，13〕。复元胶囊在保护骨组织的同时能下调炎症因子的表达，无疑对骨关节炎的治疗带来了新的思路。

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