NSE在阿尔茨海默病模型大鼠脑组织中的蛋白表达变化

贾 楠 马涤辉 常 明 宋月萍 詹 焱 (河北大学，河北 保定 0700)

阿尔茨海默病(AD)具体的病因和发病机制并不明了〔1～3〕。近年来众多的实验结果使越来越多的学者认为中枢胆碱能系统损伤可能是各种原因所致痴呆的共同归宿。乙酰胆碱(ACh)作为中枢神经系统最重要的神经递质之一，在脑内广泛存在，其主要功能是维持意识的清醒，在学习记忆中起重要作用。中枢胆碱能神经元数量的减少、ACh合成减少、ACh受体和(或)敏感性降低、ACh通路的解剖异常等都可导致学习记忆功能的障碍。各种动物实验模型均不能完整模拟人类痴呆的复杂病理及发病机制。每一种模型仅从一种角度验证某一种假说。机械切断海马通路是从胆碱能损伤的角度来设计的。本文通过2-维差异凝胶电泳的技术来检测胆碱能损伤后的AD大鼠模型脑内蛋白质的改变情况，以期可以检测一些相关的蛋白改变。

1 材料和方法

1.1 动物模型的制备和标本的留取 实验动物选取:用水迷宫筛选反应迅速、活跃、健康及清洁级雄性Wistar大鼠，鼠龄3～4个月，体重200～220 g，分笼喂养随机选取10只为1组(分为正常组、模型组)。大鼠由吉林大学基础医学院实验动物中心提供。

用10%水合氯醛腹腔注射(0.3～0.33 ml/100 g)麻醉大鼠。将头部固定在立体定向仪上，剪毛消毒，暴露颅骨，参照《大鼠脑立体定位图谱》，横断穹窿海马伞。上提刀片确定无出血后用骨蜡封闭创口，并在切口处撒少许青霉素粉剂抗炎，缝合皮肤。皮肤切开处给予少许青霉素粉剂，缝合切口即可。动物模型的制备2 w后对不同实验组大鼠进行morris水迷宫等实验确定为AD模型制备成功〔4～6〕。所有实验动物的饲养均依据中华人民共和国科学技术部发布的实验动物的饲养与使用标准。

1.2 方法

1.2.1 脑蛋白质的提取 造模成功后随机选取各实验组Wistar大鼠4只，断髓取脑，分离海马。对不同个体选择同一部位，切取同一大小组织称重后，在匀浆器中加入10倍量裂解液(30 mmol/L Thiourea，7M 尿素，4%CHAPS，1%蛋白酶抑制剂和核酸酶)，冰浴匀浆，室温裂解30 min后，15℃ 19 500 r/min离心30 min，收集上清液。应用Clean-up试剂盒去除样品杂质，然后用2D Quant定量试剂和进行蛋白定量。

1.2.2 荧光差异双向凝胶电泳(DIGE)实验鼠海马蛋白定量后，留取内标。分析胶:对内标蛋白、假手术对照组蛋白、实验组蛋白分别进行荧光(cy2、cy3、cy5)标记。按标准实验流程:水化、等电聚焦电泳，采用线性IPG胶条，进行定量蛋白上样，设定水化及电泳所需条件、此后灌制24×20 cm PAGE胶，此后进行IPG胶条平衡和转移，电泳仪垂直电泳。

1.2.3 图像分析统计学处理 Typhoon 9400激光扫描仪于荧光模式下进行成像扫描，扫描后的图像文件用DeCyder差异分析软件，找出差异表达蛋白点。蛋白的表达和匹配使用DeCyder-BP及DeCyder-BVA软件进行，进行统计学处理(蛋白点含量升高或降低20%以上认为有差异)。选取有意义蛋白点进行质谱分析。

2 结果

正常组大鼠与AD模型组大鼠海马的蛋白点分析比较，此蛋白在AD模型组中表达增强，AV Ratio为1.45，出现率为100%(P＜0.05)。蛋白点从在制备胶上切下，进行质谱分析，在NCBI上进行蛋白鉴定，经鉴定为神经元烯醇化酶(NSE)。见图 1，图 2。

图1 质谱分析

图2 两组大鼠海马蛋白点分析

3 讨论

AD作为神经系统退行性病变，一直是众多学者研究的热点，进行性的智能减退是本病的特点，胆碱能损伤是公认的致病因素之一〔4～6〕。我们在对正常大鼠及AD模型大鼠的2-维差异凝胶电泳的海马组织实验中检测到NSE含量的明显变化。此结果在两组模型大鼠的海马、额叶的免疫组织化学实验中同样得到证实〔5〕。

烯醇化酶在生物体内的糖酵解代谢途径中发挥着广泛的作用。其同工酶共五种:Q Q、B B、Y Y、Q B、Q Y，由免疫学性质不同的Q、B、Y三种亚基组合组成。已有实验证实烯醇化酶同工酶均存在于胞质中。其中在神经元及特定的神经内分泌细胞中存在的只有Y Y型的NSE。NSE在脑组织细胞的活性最高，外周神经和神经分泌组织的活性水平居中，最低值见于非神经组织、血清和脑脊液。它被发现在与神经内分泌组织起源有关的肿瘤中，导致血清中NSE明显升高。NSE主要作为一种肿瘤标志物用来检测小细胞肺癌，60%～81%小细胞肺癌病例的血清中NSE浓度升高〔7，8〕。虽然NSE浓度与转移部位没有相关性，但是与临床分期、疗效的评价及预后均有很好的相关性。此外多数的神经母细胞瘤患者的血清NSE很高，且与病情预后相关。阳性率可达96% ～100%，测定血清NSE对该类肿瘤的早期诊断及预后判断具有较高的临床价值。另外，血清NSE升高还可见于甲状腺髓样癌、嗜铬细胞瘤、转移性精原细胞癌、黑色素瘤、胰腺内分泌瘤等〔9～11〕。

胆碱能损伤可引起智能改变。而检测智能改变的临床指标是多种的智能量表:痴呆量表 MMSE、HIS、ADL(20项)等。但量表分析受患者受教程度、理解能力以及个体的差异等多种因素影响。临床脑电分析、神经病理等也不能广泛推广。如果临床上可以通过脑脊液或血液中某种特定指标的检测，来动态的判定疾病的进程、治疗后的恢复程度、疾病的转归及预后;将对临床疾病的诊断和治疗起到一定的帮助作用。通过反复动物实验，我们观察到NSE的变化;鉴于NSE的存在特殊性，当神经元受到损伤后，NSE从细胞内溢入，可进入脑脊液和血液。而脑组织中胶质细胞和其他神经组织不含NSE，那NSE是否也可以作为检测脑损伤严重程度的客观指标，从另一角度反映神经功能的缺失、智能改变的情况，是我们关心的问题，我们将对部分智能改变患者进行临床实验，以期可以寻找到有力的实验室证据，为AD的临床诊断和治疗提供帮助。

1 Cattaneo A，Calissano P.Nerve growth factor and Alzheimer＇s disease:new facts for an old hypothesis〔J〕.Mol Neurobiol，2012;46(3):588-604.

2 Donix M，Jurjanz L，Meyer S，et al.Functional imaging during recognition of personally familiar faces and places in Alzheimer＇s disease〔J〕.Arch Clin Neuropsychol，2013;28(1):72-80.

3 Matrone C，Di Luzio A，Meli G，et al.Activation of the amyloidogenic route by NGF deprivation induces apoptotic death in PC12 Cells〔J〕.J Alzheimers Dis，2008;13(1):81-96.

4 詹 焱，马涤辉，张 昱.神经干细胞移植对阿尔茨海默病大鼠行为学及不同脑色素C表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2007;27(21)2073-6.

5 Zhan Y，Ma D，Zhang Y.Effect of cotransplantated Schwann cells and neural stem cells in a rat model of Alzheimer＇s disease〔J〕.Nerve Regeneration Research，2011;6(4):245-51.

6 Zhan Y，Ma D，Zhang Y.Protective effects of the transplanted fetal neural stem cells on brain of Alzheimer＇s Disease model rats〔J〕.Nerve Regeneration Research，2010;5(11):825-32.

7 Dittadi R，Gion M.Biological variation of neuroendocrine tumor markers chromogranin A and neuron-specific enolase〔J〕.Clin Biochem，2013;46(12):1145.

8 Grandi C，Tomasi CD.Brain-derived neurotrophic factor and neuron-specific enolase，but not S100β，levels are associated to the occurrence of delirium in intensive care unit patients〔J〕.J Crit Care，2011;26(2):133-7.

9 Suzuki Y，Mogami Y，Toribe Y，et al.Prolonged elevation of serum neuron-specific enolase in children after clinical diagnosis of brain death〔J〕.J Child Neurol，2012;27(1):7-10.

10 Song TJ，Choi YC，Lee KY，et al.Serum and cerebrospinal fluid neuronspecific enolase for diagnosis of tuberculous meningitis〔J〕.Yonsei Med J，2012;53(6):1068-72.

11 Gempp E，Louge P，De Maistre S，et al.Neuron-specific enolase and S100β protein levels in recreational scuba divers with neurological decompression sickness〔J〕.Diving Hyperb Med，2014;44(1):26-9.