HPLC法测定1，2-环己烷二甲醇中非对映异构体的含量

郭文敏，李清娟，张 琪，陈素锐，邢 浩[.石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司，石家庄 050035；.石家庄职业技术学院，石家庄 05008]

盐酸鲁拉西酮（Lurasidone hydrochloride，商品名为Latuda）是第2代抗精神分裂症新药，于2010年10月28日被美国FDA批准上市，用于成人的精神分裂症。其作为一种具有双重作用的抗精神分裂症治疗药物[1-3]，同时作用于多巴胺D2受体、5-羟色胺（5-HT）7受体、5-HT1a受体、5-HT2a受体、α2c-肾上腺素受体，除可抑制注意缺陷多动障碍外，还可有效抑制5-HT2受体介导的行为，可剂量依赖性地显著抑制缓解条件性恐惧应急所致的僵滞行为。1，2-环己烷二甲醇（以下简称环己烷二甲醇）是盐酸鲁拉西酮合成中的关键起始原料，在合成反应中，环己烷二甲醇中的非对映异构体也参与反应，生成盐酸鲁拉西酮的异构体杂质，但在工艺中除去较为困难，因此严格控制环己烷二甲醇中非对映异构体的含量是合成中的一个关键控制点，但目前关于环己烷二甲醇中非对映异构体的检测方法尚未见文献报道。笔者建立了采用示差折光检测器[4-7]测定环己烷二甲醇中非对映异构体杂质的高效液相色谱（HPLC）方法，结果表明建立的方法准确、快速，为有效控制终产品盐酸鲁拉西酮中的光学异构体杂质提供了方法，为该产品的质量控制提供了保障。

1 材料

1.1 仪器

e2695 HPLC仪、2414示差折光检测器（美国Waters公司）。

1.2 药品与试剂

环己烷二甲醇对照品（批号：20120901，纯度：99.85%）、环己烷二甲醇非对映异构体对照品（批号：20120902，纯度：99.69%）、环己烷二甲醇原料药（批号：20120301、2012302、2012303，纯度：99.76%、99.71%、99.79%）均由石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司提供；甲醇为色谱纯，甲酸铵为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与检测器条件

色谱柱：Agilent Rx C8（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：0.01 mol/L甲酸铵缓冲溶液（pH 3.0）-甲醇（70∶30），流速：1.0 ml/min；进样量：20 µl；柱温：35 ℃；检测器内部温度：35 ℃，外部温度：35 ℃；采样速率：2.50 µl/s，过滤时间常数：1.0 s；极性：+；灵敏度：1250.0 nRIU/mV。

2.2 供试品溶液制备

精密称取原料药约100 mg，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.3 对照品溶液制备

精密称取环己烷二甲醇与环己烷二甲醇非对映异构体对照品各适量，分别置于10 ml量瓶中，加流动相溶解制成含环己烷二甲醇约为10 mg/ml、环己烷二甲醇非对映异构体0.01 mg/ml的溶液，摇匀，滤过，即得。

2.4 专属性考察

分别精密称取环己烷二甲醇与环己烷二甲醇非对映异构体对照品适量，加流动相溶解分别制成各自的对照品溶液及2种对照品的混合对照品溶液。依次精密吸取上述3种溶液及供试品溶液各20µl注入色谱仪，记录色谱图。结果表明，环己烷二甲醇峰与其非对映异构体峰的保留时间分别约为11、8 min，2个色谱峰之间分离度大于2.0，理论板数均高于5000，色谱图见图1。

2.5 线性关系与响应因子考察

图1 高效液相色谱图A.环己烷二甲醇对照品；B.环己烷二甲醇非对映异构体对照品；C.供试品；D.混合对照品；1.环己烷二甲醇；2.环己烷二甲醇非对映异构体Fig 1 HPLC chromatogramsA.cyclohexanedimethanol control；B.cyclohexanedimethanol diastereoisomer control；C.test sample；D.mixed control；1.cyclohexanedimethanol；2.cyclohexanedimethanol diastereoisomer

分别精密称取环己烷二甲醇对照品和环己烷二甲醇非对映异构体对照品适量，加流动相溶解并稀释制成含环己烷二甲醇分别为0.01、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/ml与非对映异构体分别为10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 µg/ml的对照品溶液；分别精密吸取20µl，注入色谱仪，记录峰面积，以质量浓度（c）为横坐标、峰面积（A）为纵坐标，进行线性回归，得环己烷二甲醇及其非对映异构体的线性方程分别为：A＝2985.5c+12.9（r＝0.9999，n＝6）、A＝2981.1c+9.5（r＝0.9999，n＝5）。结果表明，环己烷二甲醇及其非对映异构体检测质量浓度线性范围分别为0.01～10.0 mg/ml、10.0～200.0 µg/ml；且以环己烷二甲醇响应因子为1计，环己烷二甲醇非对映异构体的相对响应因子为0.996。

2.6 精密度试验

分别精密吸取环己烷二甲醇（10.0 mg/ml）及其非对映异构体（100.0 µg/ml）的对照品溶液20 µl，重复进样5次，测得二者峰面积的RSD分别为0.42%、0.44%（n＝5），表明方法精密度良好。

2.7 检测限与定量限试验

采用逐级稀释的方法制备系列质量浓度的环己烷二甲醇非对映异构体对照品溶液，进样测定。当信噪比≥10时，环己烷二甲醇非对映异构体的定量限为31 ng；当信噪比≥3时，环己烷二甲醇非对映异构体的检测限为10 ng。

2.8 重复性试验

取样品（批号：20120301）共5份，分别制备成供试品溶液，进样测定，结果样品中环己烷二甲醇和非对映异构体杂质的含量分别为99.76%、0.24%，RSD分别为1.39%、1.96%（n＝5）。

2.9 回收率试验

精密称取已知含量的样品（批号：20120301，环己烷二甲醇及其非对映异构体的含量分别为99.76%、0.24%）约100 mg各9份；于9份样品中依次精密加入环己烷二甲醇非对映异构体对照品溶液（0.3040 mg/ml）0.4、0.8、1.2 ml各3份，并制备成供试品溶液。分别精密吸取20µl，注入色谱仪，记录色谱图，计算回收率，结果见表1。

2.10 溶液稳定性考察

取“2.8”项下供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12 h时精密吸取20µl，注入色谱仪，记录色谱图，测定其峰面积。结果环己烷二甲醇及其非对映异构体峰面积的RSD分别为0.65%、0.69%（n＝6）。结果表明供试品溶液在12 h内稳定。

表1 回收率试验结果（n＝3）Tab 1Results of recovery test（n＝3）

2.11 耐用性考察

依据2010年版《中国药典》（二部）附录ⅪⅩA关于药品质量标准分析方法验证指导原则[8]，以主峰理论板数、主峰与相邻杂质峰的分离度为评价指标，分别选用以辛烷基硅烷键合硅胶为固定相、不同品牌的色谱柱（柱1：Agilent；柱2：Waters；柱3：Phenomenex），不同pH（2.9、3.0、3.1）的0.01 mol/L甲酸铵缓冲溶液，不同流动相比例，不同流速，不同柱温进行方法优化，最终确定了本试验的最佳分离分析条件即“2.1.1”项下条件。具体试验结果见表2。

表2 方法耐用性考察结果Tab 2 Results of robustness test

2.12 样品含量测定

取3批样品制备成供试品溶液后进样测定，计算样品中环己烷二甲醇非对映异构体杂质的含量，结果分别为0.19%、0.27%、0.21%。

3 讨论

3.1 色谱柱的选择

由于环己烷二甲醇与其非对映异构体为极性较为相似的化合物，前期试验中分别采用以辛烷基硅烷键合硅胶、十八烷基硅烷键合硅胶、氨基键合硅胶为填料的色谱柱进行分析。结果表明，采用辛烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，环己烷二甲醇与其非对映异构体的色谱峰峰形良好、柱效最佳；经考察不同品牌的辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱，结果表明均符合要求，本文拟定方法良好。

3.2 流动相组成的优化

由于示差折光检测器属于光学检测器，流动相中存在的微小气泡会使基线不稳，甚至影响检测，因此流动相在临用前应将缓冲溶液与有机相按比例混为一相、进行脱气后方可使用。因此本测定方法中的流动相组成是首先借助蒸发光散射检测器进行优化确定后，再采用示差折光检测器进行方法学验证研究。在选用流动相体系时，使用甲酸铵缓冲溶液，调pH为3.0，可使二者的分离度与峰形达到最佳；在有机相的选择过程中，经试验筛选使用甲醇更优，且可调空间较大。

3.3 其他应用

本方法除可用于测定环己烷二甲醇中的非对映异构体杂质外，亦可用于环己烷二甲醇及其非对映异构体的含量测定。

[1]封宇飞.抗精神病新药鲁拉西酮的药理与临床研究进展[J].中国新药杂志，2011，20（10）：853.

[2]Citrome L.Lurasidone for schizophrenia：a brief review of a new second-generation antipsychotic[J].Clin Schizophr Relat Psychoses，2011，4（4）：251.

[3]Citrome L.Lurasidone for schizophrenia：a review of the efficacy and safety profile for this newly approved second-generation antipsychotic[J].Int J Clin Pract，2011，65（2）：189.

[4]徐烨，李丽君，王乃芝，等.高效液相色谱法测定饮料中防腐剂和甜味剂[J].食品科学，2008，29（6）：339.

[5]戴传波，李建桥，胡清.采用带示差折光检测器的高效液相色谱法检测肌醇[J].化学工业与工程技术，2006，27（4）：57.

[6]龚时琼.高效液相色谱仪常用检测器的使用与维护[J].现代仪器，2009，16（1）：55.

[7]顾云，李海生.高效液相色谱法用于蜂蜜的分析及其品质评价[J].天津药学，2001，13（2）：49.

[8]国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录194-195.