塞来昔布联合NK细胞对裸鼠人肝癌皮下移植瘤生长的影响

陈 超，郭雪兴，刘军权，陈剑群

(1徐州医学院，江苏徐州221002;2中国人民解放军第九七医院;3徐州医学院附属医院)

研究表明，环氧合酶(COX-2)在肝癌细胞中高表达，并与肝癌的分化程度、转移、预后密切相关。特异性COX-2抑制剂塞来昔布通过诱导凋亡、减少增殖对多种肝细胞癌有显著的抑制作用。自然杀伤(NK)细胞为机体固有免疫细胞，其抗瘤谱较广，包括肝癌在内的多种肿瘤在使用NK细胞输注后得到缓解。但肝癌单一方案治疗效果多不令人满意，易产生耐药性，且毒副作用大。为此，2013年4～11月，我们观察了塞来昔布与NK细胞联用对裸鼠人肝癌细胞SMMC-7721皮下移植瘤生长的影响，并初步探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性BALB/c(nu/nu)裸鼠40只，4周龄，体质量18～20 g，购自中国科学院上海实验动物中心。人肝癌SMMC-7721细胞株购自中国科学院上海细胞库。SP免疫组化试剂盒和鼠抗人血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体、Bcl-2兔抗人多克隆抗体、Bax兔抗人多克隆抗体、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司;原位细胞凋亡(TUNEL)检测试剂盒购于Roche公司，核因子-κB(NF-κB)兔抗人单克隆抗体和caspase-3兔抗人单克隆抗体购于Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人肝癌 SMMC-7721细胞株在37℃、5%CO2条件下，置于含10%胎牛血清的DMEM细胞培养基中，采用0.25%的胰蛋白酶消化传代。NK细胞的培养及鉴定:取健康人外周抗凝血10 mL，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用含500 U/mL rhIL-2的NK细胞培养基调整单核细胞密度为5×108/L，于37℃、5%CO2培养箱培养，每2 d换液1次，收集培养10 d的NK细胞，加入Per-CP-Cy5.5标记的CD3、FITC标记的CD56进行细胞表面标志检测，同型对照为 PerCP-Cy5.5标记的IgG1和FITC标记的小鼠IgG2b。

1.2.2 裸鼠移植瘤模型构建 无菌环境下，取对数生长期SMMC-7721细胞，制成细胞悬液，调整细胞密度至4×107/mL，接种于裸鼠右侧背部皮下，每只注射0.1 mL，制备裸鼠移植瘤模型。

1.2.3 动物分组及给药 随机将裸鼠分为对照组、NK细胞组、塞来昔布组和联合干预组，每组10只。塞来昔布组从接种后第3天起给予塞来昔布100 mg/kg灌胃，每天给药1次，连续35 d;NK细胞组采用瘤内注射NK细胞治疗，每只瘤内注射NK细胞悬液0.6 mL，每7 d注射1次，共注射5次;联合干预组同时给予塞来昔布和NK细胞，给药剂量及途径与单用组相同;对照组同时给予灌胃和瘤内注射等量生理盐水。

1.2.4 肿瘤体积观察及肿瘤抑制率计算 接种后第7、14、21、28、35 天用游标卡尺测量肿瘤长、短径，计算肿瘤体积。肿瘤体积=π/6×(长径×短径2)，π取3.14。35 d后处死裸鼠，剥离完整肿瘤组织，记录肿瘤质量(瘤重)，计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率=(空白对照组瘤重-实验组瘤重)/空白对照组瘤重×100%。

1.2.5 移植瘤 VEGF、Bax、Bcl-2、NF-κB、caspase-3表达检测 ①肿瘤组织经10%甲醛固定后，石蜡包埋，4 μm厚连续切片。②抗原修复。③3%H2O2去离子水孵育，去除内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗。④滴加封闭液封闭。⑤滴加适当比例的一抗稀释液(用PBS稀释，现配现用，VEGF为1∶300，Bax和 Bcl-2 为 1∶150，NF-κB 和 caspase-3 为1∶300)，37℃孵育2 h。⑥PBS冲洗。⑦滴加二抗工作液，37℃孵育15 min。⑧PBS冲洗。⑨滴加辣根过氧化物酶标记的卵白素工作液，37℃孵育15 min。⑩PBS冲洗，DAB显色，自来水冲洗。进行复染、脱水、透明，用中性树胶封片。检测肿瘤组织中VEGF、Bax、Bcl-2、NF-κB、caspase-3 的表达情况，用软件 Image Pro Plus软件进行半定量分析处理。

1.2.6 移植瘤TUNEL检测 石蜡切片经脱蜡后，按Roche公司TUNEL检测试剂盒说明操作。在光学显微镜下，随机选择10个高倍镜视野，计数凋亡细胞，凋亡细胞的百分比作为凋亡指数(AI)，即AI=凋亡细胞数目/有核细胞的总数×100%。

1.2.7 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组常规病理HE染色观察 对照组肿瘤细胞生长旺盛，核固缩较少，片状坏死区面积较小，瘤组织内及其周围微血管丰富;各单用组均可见不同程度的片状坏死，瘤组织内及其周围微血管均减少;联合干预组可见大片细胞坏死。

2.2 各组移植瘤体积变化及治疗结束后肿瘤质量、抑瘤率比较 见表1、2。

2.3 各组移植瘤中 VEGF、Bcl-2、NF-κB、Ki-67、Bax和caspase-3表达比较 见表3。

表1 各组不同时间肿瘤体积比较(mm3，±s)

表1 各组不同时间肿瘤体积比较(mm3，±s)

注:与对照组相比，*P ＜0.05;与联合干预组比较，ΔP ＜0.05;与塞来昔布组比较，#P ＜0.05

组别 n肿瘤体积7 d 14 d 21 d 28 d 35 d NK 细胞组 10 262.35 ± 63.36*Δ# 370.85 ±123.54*Δ# 588.79 ±275.02*Δ 832.04 ±353.99*Δ 1 014.42 ±480.42*Δ塞来昔布组 10 118.93±121.16*Δ 205.36±152.25*Δ 356.79±255.35*Δ 517.57±274.77*Δ 727.28±461.33*Δ联合干预组 10 58.97 ± 43.64* 76.30 ± 41.03* 193.09 ±131.34* 298.94 ±238.74* 307.13 ±157.00*对照组 10 413.35 ±140.09 591.95 ±215.48 1 014.50 ±298.02 1 368.01 ±488.14 1 714.09 ±729.93

表2 各组治疗结束后肿瘤质量、抑瘤率比较

2.4 各组移植瘤细胞凋亡情况比较 对照组AI为1.32 ±0.34、NK 细胞组为 3.38 ±1.06、塞来昔布组为5.38 ±0.82、联合干预组为9.52 ±1.02。各用药组AI明显高于对照组(P均＜0.05)，且联合干预组明显高于各单用组(P均＜0.05)。

3 讨论

3.1 NK细胞及塞来昔布对肿瘤细胞的作用 NK细胞是机体抑制肿瘤生长的重要免疫监视细胞［1］。研究表明，肝癌微环境中高表达NK细胞，在抗肿瘤细胞增殖方面具有重要作用，体外培养激活的NK细胞对肝癌细胞亦有明显的杀伤作用［2，3］。塞来昔布为特异性COX-2抑制剂，具有广泛的抗肿瘤效应。体内研究证明，塞来昔布可抑制肝癌细胞增殖，促进细胞凋亡，抑制肿瘤新生血管形成等［4］。临床研究发现，体外索拉非尼、γ-生育三烯酚、氟伐地汀等与塞来昔布联用能增强塞来昔布对肝癌的抑制作用［5，6］。本研究发现，塞来昔布和NK细胞单用组较对照组肿瘤生长明显缓慢，联合干预组肿瘤生长最慢，瘤体体积、质量最小，抑瘤率最高，与实验预期一致。

表3 各组移植瘤中 VEGF、Bcl-2、NF-κB、Ki-67、Bax 和 caspase-3 达比较(±s)

表3 各组移植瘤中 VEGF、Bcl-2、NF-κB、Ki-67、Bax 和 caspase-3 达比较(±s)

注:与对照组相比，aP ＜0.05;与联合干预组比较，bP ＜0.05;与塞来昔布组比较，cP ＜0.05

组别 n VEGF Bcl-2 NF-κB Ki-67 Bax caspase-3 NK细胞组 10 273 460±14 831abc513 110± 31 174abc 35 774±2 831abc1 711 700±337 577ab 84 589± 7 098abc 90 680±10 347abc塞来昔布组 10 114 940±20 317ab 133 600± 21 524ab 13 826±3 126ab1 367 700±152 867ab118 400± 6 925ab 235 740±20 294ab联合干预组 10 29 512± 4 879a 31 420± 4 449a 7 354±1 860a 602 750±212 556ab211 550±17 993a 387 910±14 066a对照组 10 400 470±32 087 723 850±288 347 62 557±4 2732 457 000±395 397 30 441± 5 259 21 427± 5 821

3.2 塞来昔布联合NK细胞对肿瘤组织生长、转移的作用 肝癌是一种富血管性肿瘤，其生长、侵袭、转移依赖于新生血管的形成。VEGF是目前最有效的促血管生长因子，在肝癌中高表达，对肝癌新生血管形成及肿瘤生长和转移具有重要作用［7］。既往研究发现，肝癌细胞中COX-2的表达与VEGF呈正相关［8］，以VEGF及其受体 VEGFR为靶点的药物能抑制体内肝癌细胞生长和肿瘤血管生成［9，10］。本研究结果显示，NK细胞组、塞来昔布组、联合干预组移植瘤中VEGF的表达明显低于对照组，且联合干预组 VEGF的表达明显低于各单用组，与 Xu等［11］报道一致。

3.3 塞来昔布联合NK细胞对肿瘤细胞增殖的作用 Ki-67是一种细胞增殖核抗原，与细胞的有丝分裂过程密切相关［12］。Ki-67在正常细胞中一般不表达或者低表达，在肿瘤细胞中高表达，是目前标记肿瘤细胞增殖状态和恶性程度的可靠指标［13］。本研究结果显示，人肝癌细胞SMMC-7721移植瘤经塞来昔布、NK细胞作用后，Ki-67蛋白表达水平较对照组显著下降，且联合干预组Ki-67蛋白表达水平较单用组显著下降，提示塞来昔布和NK细胞联用可能通过调节细胞周期，减少增殖期的细胞数目，达到抑制肿瘤细胞增殖的作用。

3.4 塞来昔布联合NK细胞对肿瘤组织生长代谢的作用 NF-κB是一种转录因子蛋白，在肿瘤的生长中起到重要作用。研究表明，肝癌细胞中 NF-κB高表达，多种致癌因素可通过激活NF-κB促进细胞增殖、抑制凋亡、使细胞发生恶变并促进肿瘤细胞的转移，抑制NF-κB活性可以抑制肝癌细胞增殖、促进凋亡、增加肝癌细胞对化疗药物的敏感性、抑制炎症、减少肝癌血管生成等［14］。本研究结果显示，各用药组移植瘤中NF-κB的表达均明显低于对照组，联合干预组NF-κB的表达明显低于各单用组。进一步验证了塞来昔布是通过抑制HepG2细胞NF-κB因子DNA结合活性和NF-κB因子p65蛋白的表达，从而抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡，抑制肿瘤新生血管形成［15］。

3.5 塞来昔布联合NK细胞对肿瘤细胞凋亡的作用 细胞凋亡的线粒体途径通过Bcl-2家族促凋亡Bax/Bak基因与抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL基因的平衡来调控［16］。caspase是一组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶［17］，其中 caspase-3 为凋亡执行蛋白［18］。当Bcl-2/Bax升高，线粒体内cyt-c向胞质释放，从而激活胞质内上游凋亡蛋白caspase-9的表达，caspase-9诱导其下游终末凋亡蛋白 caspase-3的分裂，使caspase-3从无活性形式分裂为17及19亚单位的活性形式，最终诱导细胞凋亡［19］。鉴于 Bcl-2、Bax、caspase-3对细胞凋亡的重要性，本研究观察了各组移植瘤中Bcl-2、Bax、caspase-3表达情况，结果显示，NK细胞组、塞来昔布组、联合干预组移植瘤中Bcl-2的表达显著低于对照组，联合干预组Bcl-2的表达显著低于各单用组，且各用药组移植瘤中Bax和caspase-3的表达较对照组显著增加，联合干预组Bax和caspase-3的表达较单用组明显增加。与Winfield 等［20］报道一致。

综上所述，塞来昔布联合NK细胞具有良好的协同增效作用，可明显抑制裸鼠人肝癌细胞SMMC-7721皮下移植瘤的生长;其作用机制可能与促进凋亡受体通路上的Bax、caspase-3的表达，抑制VEGF、Bcl-2、NF-κB、Ki-67 的表达有关。

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