木质素降解细菌的分离与生化特性研究

文/屈森虎 杨 磊 陈 媛

前言

木质素的资源十分丰富，是植物光合作用制造的总量仅次于纤维素的有机化合物，估计全球的木质素年产量可达到1500亿吨。然而，木质素资源并没有得到有效的利用，大量的木质素作为造纸工业的副产物而排放，不仅是资源的一大浪费，而且严重污染环境。采用物理和化学处理法，可减少约50% 的木质素排放，但治理成本高，易造成二次污染。利用生物技术降解木质素，可以减少环境污染，变废为宝，实现资源再利用。因此，认识木质素的结构特点和了解其生物降解的研究进展，对于木质素资源的合理化利用将具有一定的指导意义。

概况

木质素（lignin）是由四种醇单体（对香豆醇、松柏醇、5-羟基松柏醇、芥子醇）形成的一种复杂酚类聚合物。木质素是构成植物细胞壁的成分之一，具有使细胞相连的作用。在植物组织中具有增强细胞壁及黏合纤维的作用。其组成与性质比较复杂，并具有极强的活性。不能被动物所消化，在土壤中能转化成腐殖质。如果简单定义木质素的话，可以认为木质素是对羟基肉桂醇类的酶脱氢聚合物。

实验步骤

两种不同来源：木质素黑液、经木质素黑液驯化4个月后的土壤。

LB培养基：酵母浸膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、琼脂19.0g、蒸馏水1000ml。

方法：（1）木质素黑液的配制：称取11.0125g粗木质素，加水定容至1000ml，作梯度稀释10-1、10-2、10-3。每个梯度做3个样。（2）制作平板。LB-培养基：培养皿编号后，将已融化并冷却至50℃左右的培养基倒入培养皿中。RB-LB培养基：将灭菌后一定体积浓度为5mg/ml 的RB亮蓝溶液与灭菌后冷却到60℃左右的LB培养基混匀（图1所示）。（3）将木质素黑液接到RB-LB平板上，分别进行梯度稀释10-1、10-2、10-3 、10-4、10-5 。取5个样，每个样品制作2个平行样品，一共10个样品。再从RB-LB培养基上挑出有颜色变化的菌落接到LB培养基的平板上，进行分离提纯，筛出来纯种菌落。（图2所示）

细菌的木质素降解率的测定

培养基：无机盐培养基 L-MSM。

磷酸氢二钠2.4g、磷酸氢二钾2.0g、硝酸铵0.1g、硫酸镁0.01g、氯化钙0.01g、葡萄糖10g、蛋白胨5g、trace element solution 1ml、Kraft Lignin500mg、蒸馏水1000ml、PH 7.6 。

方法：在250ml锥形瓶中加入约100ml的L-MSM液体培养基，接入经过一夜液体培养的菌液1ml，一共做3个平行的锥形瓶，不接入的L-MSM培养基作为空白组，然后放入摇床培养（120rpm，30℃）。连续培养十四天，每天定期取样测定降解率，分别取空白组和实验组各30ml，在8000r/min的条件下，离心15min，去取上清液并用HCl酸化至PH1-2，然后去离心（8000r/min，离心30min），从而得到酸沉物，拿去烘干（60-65℃，条件下烘48h），最后称重。（其中假定空白组最后烘干得到的重量为100%）。

计算结果

FPA酶活力按下式计算：

X1=A×1/0.5×n

式中：

X1—样品的滤纸酶活力（FPA），u/g（或u/ml）；A—根据吸光度在标准曲线上查的（或计算出）的还原糖量，m g；1/0.5—换算成酶液1ml；n—酶样的稀释倍数。

图1 RB-LB培养基

图2 筛选后的纯种菌落

结语

本文的主要内容是进行木质素降解细菌的分离与生化特性研究，从细菌的筛选与提纯、测定细菌的木质素降解率、酶活等实验进行了分析与研究，得出了以下结论。

（1）筛菌结果：细菌的来源分别为木质素黑液与经木质素黑液驯化4个月后的土壤，通过接菌、梯度稀释进行分离提纯，筛出来纯种菌落，得到13个细菌。（2）细菌的木质素降解率：将经过一夜培养的菌液加入到无机盐培养基中，并加一个空白做对照，由测得的质量计算得出每天的降解率。通过对13种细菌进行数据对比，可以看出1、4、10、11、12、13号菌的木质素降解率比较高，说明它们的降解效果较其他细菌更明显。（3）细菌的纤维素酶活：纤维素酶是指在各种酶组分的协同作用下，能降解纤维素酶、使之变成纤维寡糖、纤维二糖和葡萄糖的酶。测定酶活采用的是纤维素酶制剂QB2583-2003，培养基为产酶培养基，分别测第二、第四、第六、第八、第十天酶活。酶活高说明其还原糖含量高，从实验数据可分析得出1、2、3、4、11、12号这五种菌的酶活较优秀。（4）细菌的微生物鉴定：根据细菌的木质素降解率与酶活数据挑选出1、4、11号三种菌进行微生物鉴定，结果为：1号菌是无色杆菌、4号菌是木糖氧化无色杆菌、11号菌是溶血性葡萄球菌。（5）生物强化实验结果：测定COD采用的是参见国标GB11914-89。结果从曲线图可以明显看出1、11号细菌第七天测的COD比不加菌的都高，而4号菌比其他三个都小很多。因此，单从数据上比较，4号菌的优势相对大一些，说明4号菌的降解能力较为优秀。测定色度采用的是GB11903-89，把13种细菌接入用秸秆粉末作为碳源的培养基，经过十天锥形瓶内颜色有明显差异，其中3、4、7、8、11、12这几种细菌接入培养基后颜色比其它菌要淡很多。说明这几种细菌对于木质素降解是有效果的。

综上所述，4号菌木糖氧化无色杆菌降解能力最为优秀。