液相色谱—质谱法对柑橘中吡唑醚菌酯残留的检测

刘军+张仙+沈菁+祁志红

摘要：建立了高效液相色谱-质谱法检测柑橘中吡唑醚菌酯残留量的方法。柑橘经乙腈提取，Carbon/NH2柱净化，实现样品的制备。在岛津VP-ODS色谱柱上，以乙腈和0.1%甲酸溶液（70+30，V/V）为流动相，采用电喷雾正离子（ESI+） SIM扫描模式，以m/z 388为定量检测离子，吡唑醚菌酯保留时间为6.3 min，在0.01～0.50 mg/L内呈良好的线性关系， R2为0.999 8。在柑橘样品（全果、果肉）中添加0.05、 0.20、 2.00 mg/kg的吡唑醚菌酯标准样品，其回收率为101%～115%，相对标准偏差（RSD）均小于5%。最低检出量（S/N=10）为3.4×10-13 g。准确度和精密度均能满足检测要求。

关键词：吡唑醚菌酯；残留；液相色谱-质谱

中图分类号：O657.63 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）19-4698-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.050

Determination of Pyraclostrobin Residue in Citrus by LC-MS

LIU Jun， ZHANG Xian， SHEN Jing， QI Zhi-hong

（Agricultural Quality Standards and Inspection Technology Research Institute， Hubei Academy of Agricultural Science， Wuhan 430064，China）

Abstract： A method for determing pyraclostrobin residues in whole fruit of citrus and citrus pulp was established with by LC-ESI-MS. Pyraclostrobin residues were extracted from samples with acetonitrile， cleaned up by ProElut Carbon/NH2 SPE to achieve sample preparation， and separated on the Shimadzu VP-ODS column， using a mixture of acetonitrile and 0.1% formic acid solution （70+30，V/V） as mobile phase. Determination was made by using ESI under the mode of SIM. Quantitative detection of ions was m/z 388， the retention time of pyraclostrobin was 6.3 min. Linearity were held in the ranges of 0.01～0.50 mg/L with the correlation coefficient of 0.999 8. The average recoveries of pyraclostrobin in whole fruit of citrus and citrus pulp at the spiked amounts of 0.05～2.00 mg/kg were 101%～115%， and the relative standard deviation was lower than 5.0%. The limit of detectable amount （S/N=10） was 1.3×10-13 g. The accuracy and precision of this method can meet the requirements of detection.

Key words： pyraclostrobin； residue； LC-ESI-MS

吡唑醚菌酯（Pyraclostrobin），又名唑菌胺酯、百克敏，是兼具吡唑结构的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，是由德国巴斯夫公司于1993年开发，2001年登记并上市，目前已用于100多种作物上，可以防治由多种真菌病原引起的病害[1]，同样能够防治柑橘的酸腐病、青霉病。目前，关于吡唑醚菌酯的检测方法有吴洁珊等[2]采用气相色谱测定柑橘中多种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的残留量；薄海波等[3]采用气相色谱—质谱法测定食品中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留；徐英江等[4]采用液相色谱串联质谱测定蔬菜中残留的唑菌胺酯；以及在西瓜[5]、甘蓝[6]、葡萄[7]、花生[8]、土壤[9]等介质中的残留均有研究。

柑橘在采摘后的储藏和运输过程中容易发生酸腐病和青霉病，目前市场上对于防止柑橘储藏和运输过程中霉变腐烂多采用采摘前喷药和采摘后浸药的方式，但是用药种类却没有统一的标准，而吡唑醚菌酯作为一种低毒高效的杀菌剂，浸果可以延缓其腐烂霉变。本研究旨在为吡唑醚菌酯在柑橘储藏中使用申请的残留试验，对柑橘全果和柑橘果肉中的残留检测均有研究，针对性强、准确度高，能满足残留检测要求。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

LC-20AD 高效液相色谱仪（日本岛津公司），配备LC-MS 2010 EV质谱检测器和电喷雾电离源，自动进样器，LC-MS工作站。

吡唑醚菌酯标准样品（99.7%，上海市农药研究所），甲醇、乙腈（色谱纯，美国J.T.Baker公司），甲酸（99.0%，美国Acros Organics公司），氯化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），去离子水由Barnstead 超纯水机制备，其他试剂均为分析纯。

1.2 样品前处理

称取搅碎后的柑橘全果、果肉样品10.0 g（精确到0.01 g）于100 mL离心管中，加入20 mL乙腈，以21 000 r/min匀质2 min，加入3.0 g氯化钠，高速涡旋1 min。以3 500 r/min离心5 min，移取出上清液5 mL（相当于2.5 g样品）待净化。

1.3 样品净化

将移取出的5 mL提取液加入已经过5 mL乙腈+甲苯（3∶1，V/V）预淋洗Carbon/NH2柱（6 mL，1 000 mg），收集淋洗液，再用15 mL乙腈+甲苯（3∶1，V/V）分3次洗脱，合并淋洗液，于70 ℃水浴锅蒸发近干，用2.5 mL甲醇定容，过0.22 μm滤膜，待质谱检测。

1.4 液相色谱—质谱条件

色谱柱为岛津VP-ODS （150 mm×2.0 mm ， 5 μm）；流动相采用含 0.1%甲酸溶液和乙腈（70+30， V/V）；流速为0.2 mL/min；进样体积为5 μL；柱温为35 ℃；离子源 ESI+，SIM 扫描模式（m/z 388）；CDL温度为250 ℃； 加热模块温度为200 ℃；雾化气流速（N2）为1.5 L/min；干燥气（N2）压力为60 kPa；检测电压为1.75 kV。

2 结果与分析

2.1 定量离子的选择

在上述色谱条件下选择SCAN（+）模式，以10 mg/L的吡唑醚菌酯标准品溶液，扫描得到全扫描质谱图（图1）。由图1可见，m/z 388（M+H）的为目标离子，所以选择m/z 388 为定量离子。以m/z 388为定量离子采用SIM（+）模式，柑橘全果中的吡唑醚菌酯的添加回收图谱、标准样品图谱以及空白谱图见图2，果肉中的谱图见图3。

2.2 线性范围和检出限

配制吡唑醚菌酯标准样品0.01、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L，经仪器检测，以m/z 388质量色谱图峰面积为纵坐标，以对应的吡唑醚菌酯质量浓度（mg/L）为横坐标，绘制标准曲线，见图4，其线性回归方程为：y=697 983 8x+170 936 3，R2为0.999 8。按S/N=10的信噪比计算吡唑醚菌酯最低检出量为3.4×10-13 g。

2.3 SPE柱洗脱溶剂体积的选择

在空白柑橘样品10.0 g中添加0.10 mg/kg水平的吡唑醚菌酯标准样品，按上述方法提取，样品净化时洗脱溶剂乙腈和甲苯（3∶1，V/V）的用量按每次5 mL，共5次分开收集，分别蒸发近干，定容2.5 mL，过0.22 μm滤膜，进质谱检测。检测数据见表1。由表1可得，前10 mL已将目标物洗脱完全，为了确保在大量的样品检测过程中彻底洗脱，以15 mL为最佳淋洗体积。

2.4 方法的添加回收率和最小检出浓度

在田间采摘未施药的柑橘制成全果、果肉空白样品，分别添加0.05、0.20、2.00 mg/kg 3个水平，每个水平重复5次，检测结果见表2。从表2可得，添加样品中吡唑醚菌酯加标回收率为 101%～115 %，相对标准偏差（n=5）为1.3 %～4.7 %。以最小添加浓度0.02 mg/kg作为最小检出浓度，其回收率、相对标准偏差和最小检测浓度都能满足农药登记残留试验的要求。

3 小结与讨论

本研究采用乙腈提取，Carbon/NH2柱净化，液相色谱-质谱法检测吡唑醚菌酯在柑橘（全果、果肉）中的残留，该方法操作简单，其添加回收率、精确度和最小检出浓度均能达到农药登记残留试验的要求。

参考文献：

[1] 杨丽娟，柏亚罗.甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂——吡唑醚菌酯[J]. 现代农药，2012，11（4）：46-50.

[2] 吴洁珊，冯家望，任永霞，等.气相色谱测定柑橘中多种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的残留量[J].农药，2011，50（10）：754-755.

[3] 薄海波，王金花，郭春海，等.气相色谱/质谱法测定食品中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留[J].分析化学研究报告，36（11）：1471-1475.

[4] 徐英江，耿金培，张秀珍，等.液相色谱串联质谱测定蔬菜中残留的唑菌胺酯[J].化学研究与应用，2009，21（12）：1704-1707.

[5] 张志勇，王冬兰，刘贤进.西瓜与土壤中吡唑醚菌酯残留的分析方法[J].安徽农业科学，2010，38（34）：19386-19387.

[6] 王 岩，姚威风，梁 爽，等.甘蓝和土壤中吡唑醚菌酯·烯酰吗啉残留分析[J].农药，2011，50（1）：46-47.

[7] 李瑞娟，于建垒，宋国春.葡萄和土壤中吡唑醚菌酯的高效液相色谱残留分析方法[J].农药科学与管理，2010，31（6）：33-36.

[8] ZHANG F Z，WANG L，ZHOU L，et al. Residue dynamics of pyraclostrobin in peanut and field soil by QuEChERS and LC-MS/MS[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，2012，78（4）：116-122.

[9] 吴 迪，聂向云，张希跃，等.壤中吡唑醚菌酯的残留分析方法和消解动态研究[J].农药科学与管理，2012，33（7）：25-28.

1.2 样品前处理

称取搅碎后的柑橘全果、果肉样品10.0 g（精确到0.01 g）于100 mL离心管中，加入20 mL乙腈，以21 000 r/min匀质2 min，加入3.0 g氯化钠，高速涡旋1 min。以3 500 r/min离心5 min，移取出上清液5 mL（相当于2.5 g样品）待净化。

1.3 样品净化

将移取出的5 mL提取液加入已经过5 mL乙腈+甲苯（3∶1，V/V）预淋洗Carbon/NH2柱（6 mL，1 000 mg），收集淋洗液，再用15 mL乙腈+甲苯（3∶1，V/V）分3次洗脱，合并淋洗液，于70 ℃水浴锅蒸发近干，用2.5 mL甲醇定容，过0.22 μm滤膜，待质谱检测。

1.4 液相色谱—质谱条件

色谱柱为岛津VP-ODS （150 mm×2.0 mm ， 5 μm）；流动相采用含 0.1%甲酸溶液和乙腈（70+30， V/V）；流速为0.2 mL/min；进样体积为5 μL；柱温为35 ℃；离子源 ESI+，SIM 扫描模式（m/z 388）；CDL温度为250 ℃； 加热模块温度为200 ℃；雾化气流速（N2）为1.5 L/min；干燥气（N2）压力为60 kPa；检测电压为1.75 kV。

2 结果与分析

2.1 定量离子的选择

在上述色谱条件下选择SCAN（+）模式，以10 mg/L的吡唑醚菌酯标准品溶液，扫描得到全扫描质谱图（图1）。由图1可见，m/z 388（M+H）的为目标离子，所以选择m/z 388 为定量离子。以m/z 388为定量离子采用SIM（+）模式，柑橘全果中的吡唑醚菌酯的添加回收图谱、标准样品图谱以及空白谱图见图2，果肉中的谱图见图3。

2.2 线性范围和检出限

配制吡唑醚菌酯标准样品0.01、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L，经仪器检测，以m/z 388质量色谱图峰面积为纵坐标，以对应的吡唑醚菌酯质量浓度（mg/L）为横坐标，绘制标准曲线，见图4，其线性回归方程为：y=697 983 8x+170 936 3，R2为0.999 8。按S/N=10的信噪比计算吡唑醚菌酯最低检出量为3.4×10-13 g。

2.3 SPE柱洗脱溶剂体积的选择

在空白柑橘样品10.0 g中添加0.10 mg/kg水平的吡唑醚菌酯标准样品，按上述方法提取，样品净化时洗脱溶剂乙腈和甲苯（3∶1，V/V）的用量按每次5 mL，共5次分开收集，分别蒸发近干，定容2.5 mL，过0.22 μm滤膜，进质谱检测。检测数据见表1。由表1可得，前10 mL已将目标物洗脱完全，为了确保在大量的样品检测过程中彻底洗脱，以15 mL为最佳淋洗体积。

2.4 方法的添加回收率和最小检出浓度

在田间采摘未施药的柑橘制成全果、果肉空白样品，分别添加0.05、0.20、2.00 mg/kg 3个水平，每个水平重复5次，检测结果见表2。从表2可得，添加样品中吡唑醚菌酯加标回收率为 101%～115 %，相对标准偏差（n=5）为1.3 %～4.7 %。以最小添加浓度0.02 mg/kg作为最小检出浓度，其回收率、相对标准偏差和最小检测浓度都能满足农药登记残留试验的要求。

3 小结与讨论

本研究采用乙腈提取，Carbon/NH2柱净化，液相色谱-质谱法检测吡唑醚菌酯在柑橘（全果、果肉）中的残留，该方法操作简单，其添加回收率、精确度和最小检出浓度均能达到农药登记残留试验的要求。

参考文献：

[1] 杨丽娟，柏亚罗.甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂——吡唑醚菌酯[J]. 现代农药，2012，11（4）：46-50.

[2] 吴洁珊，冯家望，任永霞，等.气相色谱测定柑橘中多种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的残留量[J].农药，2011，50（10）：754-755.

[3] 薄海波，王金花，郭春海，等.气相色谱/质谱法测定食品中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留[J].分析化学研究报告，36（11）：1471-1475.

[4] 徐英江，耿金培，张秀珍，等.液相色谱串联质谱测定蔬菜中残留的唑菌胺酯[J].化学研究与应用，2009，21（12）：1704-1707.

[5] 张志勇，王冬兰，刘贤进.西瓜与土壤中吡唑醚菌酯残留的分析方法[J].安徽农业科学，2010，38（34）：19386-19387.

[6] 王 岩，姚威风，梁 爽，等.甘蓝和土壤中吡唑醚菌酯·烯酰吗啉残留分析[J].农药，2011，50（1）：46-47.

[7] 李瑞娟，于建垒，宋国春.葡萄和土壤中吡唑醚菌酯的高效液相色谱残留分析方法[J].农药科学与管理，2010，31（6）：33-36.

[8] ZHANG F Z，WANG L，ZHOU L，et al. Residue dynamics of pyraclostrobin in peanut and field soil by QuEChERS and LC-MS/MS[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，2012，78（4）：116-122.

[9] 吴 迪，聂向云，张希跃，等.壤中吡唑醚菌酯的残留分析方法和消解动态研究[J].农药科学与管理，2012，33（7）：25-28.

1.2 样品前处理

称取搅碎后的柑橘全果、果肉样品10.0 g（精确到0.01 g）于100 mL离心管中，加入20 mL乙腈，以21 000 r/min匀质2 min，加入3.0 g氯化钠，高速涡旋1 min。以3 500 r/min离心5 min，移取出上清液5 mL（相当于2.5 g样品）待净化。

1.3 样品净化

将移取出的5 mL提取液加入已经过5 mL乙腈+甲苯（3∶1，V/V）预淋洗Carbon/NH2柱（6 mL，1 000 mg），收集淋洗液，再用15 mL乙腈+甲苯（3∶1，V/V）分3次洗脱，合并淋洗液，于70 ℃水浴锅蒸发近干，用2.5 mL甲醇定容，过0.22 μm滤膜，待质谱检测。

1.4 液相色谱—质谱条件

色谱柱为岛津VP-ODS （150 mm×2.0 mm ， 5 μm）；流动相采用含 0.1%甲酸溶液和乙腈（70+30， V/V）；流速为0.2 mL/min；进样体积为5 μL；柱温为35 ℃；离子源 ESI+，SIM 扫描模式（m/z 388）；CDL温度为250 ℃； 加热模块温度为200 ℃；雾化气流速（N2）为1.5 L/min；干燥气（N2）压力为60 kPa；检测电压为1.75 kV。

2 结果与分析

2.1 定量离子的选择

在上述色谱条件下选择SCAN（+）模式，以10 mg/L的吡唑醚菌酯标准品溶液，扫描得到全扫描质谱图（图1）。由图1可见，m/z 388（M+H）的为目标离子，所以选择m/z 388 为定量离子。以m/z 388为定量离子采用SIM（+）模式，柑橘全果中的吡唑醚菌酯的添加回收图谱、标准样品图谱以及空白谱图见图2，果肉中的谱图见图3。

2.2 线性范围和检出限

配制吡唑醚菌酯标准样品0.01、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L，经仪器检测，以m/z 388质量色谱图峰面积为纵坐标，以对应的吡唑醚菌酯质量浓度（mg/L）为横坐标，绘制标准曲线，见图4，其线性回归方程为：y=697 983 8x+170 936 3，R2为0.999 8。按S/N=10的信噪比计算吡唑醚菌酯最低检出量为3.4×10-13 g。

2.3 SPE柱洗脱溶剂体积的选择

在空白柑橘样品10.0 g中添加0.10 mg/kg水平的吡唑醚菌酯标准样品，按上述方法提取，样品净化时洗脱溶剂乙腈和甲苯（3∶1，V/V）的用量按每次5 mL，共5次分开收集，分别蒸发近干，定容2.5 mL，过0.22 μm滤膜，进质谱检测。检测数据见表1。由表1可得，前10 mL已将目标物洗脱完全，为了确保在大量的样品检测过程中彻底洗脱，以15 mL为最佳淋洗体积。

2.4 方法的添加回收率和最小检出浓度

在田间采摘未施药的柑橘制成全果、果肉空白样品，分别添加0.05、0.20、2.00 mg/kg 3个水平，每个水平重复5次，检测结果见表2。从表2可得，添加样品中吡唑醚菌酯加标回收率为 101%～115 %，相对标准偏差（n=5）为1.3 %～4.7 %。以最小添加浓度0.02 mg/kg作为最小检出浓度，其回收率、相对标准偏差和最小检测浓度都能满足农药登记残留试验的要求。

3 小结与讨论

本研究采用乙腈提取，Carbon/NH2柱净化，液相色谱-质谱法检测吡唑醚菌酯在柑橘（全果、果肉）中的残留，该方法操作简单，其添加回收率、精确度和最小检出浓度均能达到农药登记残留试验的要求。

参考文献：

[1] 杨丽娟，柏亚罗.甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂——吡唑醚菌酯[J]. 现代农药，2012，11（4）：46-50.

[2] 吴洁珊，冯家望，任永霞，等.气相色谱测定柑橘中多种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的残留量[J].农药，2011，50（10）：754-755.

[3] 薄海波，王金花，郭春海，等.气相色谱/质谱法测定食品中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留[J].分析化学研究报告，36（11）：1471-1475.

[4] 徐英江，耿金培，张秀珍，等.液相色谱串联质谱测定蔬菜中残留的唑菌胺酯[J].化学研究与应用，2009，21（12）：1704-1707.

[5] 张志勇，王冬兰，刘贤进.西瓜与土壤中吡唑醚菌酯残留的分析方法[J].安徽农业科学，2010，38（34）：19386-19387.

[6] 王 岩，姚威风，梁 爽，等.甘蓝和土壤中吡唑醚菌酯·烯酰吗啉残留分析[J].农药，2011，50（1）：46-47.

[7] 李瑞娟，于建垒，宋国春.葡萄和土壤中吡唑醚菌酯的高效液相色谱残留分析方法[J].农药科学与管理，2010，31（6）：33-36.

[8] ZHANG F Z，WANG L，ZHOU L，et al. Residue dynamics of pyraclostrobin in peanut and field soil by QuEChERS and LC-MS/MS[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，2012，78（4）：116-122.

[9] 吴 迪，聂向云，张希跃，等.壤中吡唑醚菌酯的残留分析方法和消解动态研究[J].农药科学与管理，2012，33（7）：25-28.