羟基红花黄色素A改善SD大鼠心肌缺血/再灌注损伤

许爱斌，刘建国，张健，李俊峡

心肌缺血是冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）的基本病理生理过程，有效地恢复缺血心肌的再灌注，是治疗的最根本措施[1]。但恢复正常的血流灌注，缺血区的损伤反而加重并引发心肌缺血/再灌注（myocardial ischemia/reperfusion，MI/R）损伤[2]。MI/R损伤是冠心病患者致死致残相关的一个主要因素[3]。如何减轻甚至消除MI/R损伤，是目前冠心病血管再通治疗急需解决的难题。临床上一直在寻找治疗MI/R损伤的药物，而中草药能够有效治疗冠心病，改善心肌缺血损伤，如丹红注射液[4]，同时这些中草药相对副作用较小。红花是丹红注射液的重要成分，红花功能主治是活血化瘀，而红花黄素是其水提取物，羟基红花黄素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）是其主要药效成分[5]。但是，对于其改善心肌缺血的具体机制尚不明确。本研究拟建立大鼠MI/R损伤模型，并探讨HSYA对缺血损伤心肌的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 Sprague Dawley（SD）大鼠30只，清洁级，体重（200±20）g，雌雄各半，许可证号：SCXK-（军）2007-007，购自第四军医大学实验动物中心。清洁级饲养，正常饲养，术前12 h禁食，自由饮水。

1.2 药物 HSYA购自中国药品生物制品检定所（批号：111637-200905）。

1.3 主要试剂与仪器 肌酸激酶同工酶（CKM B），肌钙蛋白I（c T n I），白介素-1（IL-1），白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子（TNF-α）酶联免疫检测试剂盒（sigma，美国）；氯化三苯基四氮唑，伊文思蓝（碧云天，中国）。HX-100E小动物呼吸机（成都泰盟科技），恒温摇床（上海福玛），酶联免疫检测仪（TECAN）。

1.4 模型建立 造模方法参考文献[6]，实验大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠2 ml/kg麻醉，仰卧位固定，连接Ⅱ导联心电图监测，暴露气管，分离左颈总动脉并进行插管，打开胸腔，暴露心脏，以左心耳与肺动脉圆锥交界处的左冠状动脉前降支为标志，于左心耳下方1～2 mm处进针、穿线（横跨左冠状动脉前降支），将一小硅胶管从丝线两端穿入，稳定10 min后结扎，缺血30 min后，再灌注3 h结束。假手术组动物只穿线不结扎。成功标准：结扎冠状动脉左前降支后，心电图Ⅱ导联ST段弓背向上抬高，T波高耸，肉眼观察结扎线下心肌组织颜色呈苍白色为缺血成功；放松结扎线后，以抬高的ST段下降1/2以上为再灌注成功。

1.5 分组 本实验将 SD 大鼠随机分为 3 组：假手术组（Sham组）、模型组（MI/R组）、HSYA治疗组（MI/R+ HSYA组）。再灌注即刻给药，直接注射到分离出来的冠状动脉中。MI/R组注射生理盐水，MI/R+ HSYA注射5 mg/kg HSYA。假手术组只穿线不结扎。

1.6 检测指标

1.6.1 心肌梗死测量 实验结束后颈静脉注射伊文思蓝（Evans Blue，EB）（5 g/L）2 ml，30 min 后打开胸腔，取出心脏，生理盐水充分洗净残血，滤纸吸干，剪去血管、结缔组织、心房和右心室，留下左心室。将左心室置于-20℃冰箱冷冻30 min，平行房室沟将其切成5-8片，每片厚1～2 mm。切片置于 1%氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）中 37℃孵育15 min，随后用多聚甲醛固定，正常心肌组织染成蓝色，缺血心肌组织染成红色。Image ProPlus图像分析：将切片展开平铺于载玻片上，采用数码相机拍摄，导出的照片利用图像分析软件Image ProPlus 进行梗死面积的计算。公式如下所示：梗死区面积（infarct zone, IZ%）= 梗死区/（梗死区＋缺血区）×100%。危险区面积（risk zone，RZ%）=（梗死区＋缺血区）/除去左心室的心肌面积×100%。

1.6.2 HE染色 实验结束取大鼠心尖处组织一小块，用 4℃生理盐水冲洗干净，将标本放入4%多聚甲醛中固定24～72 h，依次经梯度乙醇脱水，二甲苯透明之后进行石蜡包埋，切片HE染色。

1.6.3 血流动力学及心电图检测 SD大鼠被麻醉之后，电极位置参照ECG导联的标准，用针电极插入大鼠四肢皮下相应部位。测定左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张末压（LVEDP）、收缩压最大上升速率（+dp/dt max）及舒张压最大下降速率（-dp/dt max）等心功能指标。

1.6.4 CK-MB和cTnI检测 实验结束时从SD大鼠颈动脉取血，后室温静置20 min，3500转离心12 min后取血清，按照所购试剂盒的说明书严格操作，检测 CK-MB和cTnI。

1.6.5 炎症因子检测 按照所购试剂盒的说明书，检测血清IL-1、IL-6 和 TNF-α含量。

1.7 统计学方法 SPSS 16.0统计软件分析，计量资料以（x±s）表示，三组间均数比较采用方差分析，组间均数比较运用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌梗死面积观察 各处理组大鼠心肌危险区（risk zone，RZ）及梗死区（infarct zone，IZ）的数据如图1。各处理组危险区没有显著性差异（P=0.27）。MI/R组大鼠心肌梗死百分比达（43.26±10.09）%，而MI/R+HSYA组梗死面积显著低于MI/R组（27.34±7.83）%，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 组织学观察 假手术组心肌纤维排列整齐，心肌细胞形态均一，MI/R组心肌纤维紊乱，细胞形态混浊肿胀，并有大量炎性细胞浸润，MI/R+HSYA组显著减轻心肌损伤，纤维结构与Sham组类似（图2）。

2.3 血流动力学及心电图监测结果 缺血30 min和再灌注3 h的各组大鼠心功能指标的变化如表1所示。在测量的不同时间点，MI/R组的LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax及HR均较Sham组降低（P＜0.05）。给予HSYA治疗后，以上参数均较MI/R组升高（P＜0.05）。

图1 HSYA减少MI/R大鼠心肌梗死面积（与MI/R组比较，**P＜0.05）

图2 HSYA改善MI/R大鼠心肌组织结构

2.4 心肌损伤标志物检测结果 图3所示各处理组大鼠血清中CK-MB、cTnI的浓度。MI/R组SD大鼠血清中CK-MB和cTnI的浓度均显著高于Sham组（P＜0.05），HSYA治疗组CK-MB和cTnI水平较MI/R组显著降低（P＜0.05）。

2.5 对大鼠心肌缺血再灌注损伤后炎症因子的影响 图4所示为各组大鼠血清中IL-1、IL-6及TNF-α浓度。MI/R组SD大鼠血清中IL-1、IL-6及TNF-α的浓度显著高于Sham组（P＜0.05），MI/R+HSYA组 IL-1、IL-6及TNF-α水平较 MI/R组有所降低（P＜0.05）。

3 讨论

图4 HSYA降低MI/R大鼠血清中IL-1、IL-6和TNF-α水平（与Sham组比较，##P＜0.05；与MI/R组比较，**P＜0.05）

冠心病尤其是急性心肌梗死严重危害着患者的健康和生命，目前临床上内科治疗主要是采取冠状动脉球囊扩张和支架置入的方法，外科采取冠脉旁路移植的方法，经过治疗后，及时再通堵塞的冠状动脉，使心肌重新获得血液提供的营养和氧分[7]。但是MI/R损伤日益受到心脏病学家的高度关注[8]。本实验在大鼠缺血再灌注模型中研究中药丹参红花配方中的药效成分之一HSYA，探讨其对缺血再灌注损伤的改善有无影响。

临床上，MI/R导致的梗死面积大小通常被用来评价损伤的严重程度[9]。本实验通过EB/TTC染色计算出各组的梗死面积大小，结果显示HSYA能减少梗死面积，说明其对MI/R损伤有一定的保护作用，这与文献报道一致[10]。

血清检测指标心肌损伤标志物是临床上诊断心肌损伤的常用指标，其中CK-MB被认为是急性心肌梗死的重要诊断指标之一[11]。cTnI是一种心肌收缩调节蛋白，对心肌损伤比其他心肌酶类更具高敏感性和高特异性[12]。本实验中在给予HSYA治疗的大鼠血清中检测到的上述两种心脏标志物的含量均要降低，说明HSYA能降低MI/R损伤，这与大体结果的梗死面积缩小是一致的。

MI/R损伤使得缺血心肌无法通过目前的再灌注疗法获得最佳疗效，研究如何预防或减轻再灌注损伤己成为当前冠心病治疗的热点问题[13]。目前关于MI/R研究很多，认为导致MI/R 损伤的主要机制包括：氧化应激、炎症反应、钙离子超载、能量代谢障碍等等，IL-1、IL-6 及TNF-α是炎症过程中起重要作用的细胞因子，在损伤的发生发展中起重要作用[14]。但关于HSYA对MI/R过程中的炎症有无抑制作用尚未明确。本研究检测到HSYA治疗组的IL-1、IL-6 及TNF-α均有所降低，这说明其可能使通过抑制MI/R 损伤过程中产生的炎症反应来发挥心肌保护作用的。

本研究发现，HSYA可明显减少MI/R 损伤后的心肌梗死面积，同时对心肌缺血和梗死引起的CK-MB和cTnI释放有明显的抑制作用，明显改善心功能。HSYA对心肌的保护作用可能主要是通过抑制炎症因子的释放，从而达到增加心肌血流量，改善心肌氧代谢，减少MI/R损伤。

表1 HSYA改善MI/R大鼠心功能

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