复方萘甲唑啉滴眼液无菌检查方法的验证

余晓霞 刘春霞 李磊

复方萘甲唑啉滴眼液为中山大学孙逸仙纪念医院配制的眼用制剂, 其主要成分为盐酸萘甲唑啉、马来酸氯苯那敏、硼酸和羟苯乙酯等, 具有减轻眼睛刺激感和结膜充血的作用,临床适用于过敏性引起的眼睛炎症。《中国药典》2010年版［1］首次将无菌检查纳入眼用制剂检查项下。因此, 需建立复方萘甲唑啉滴眼液无菌检查方法并进行验证。

1 仪器与材料

1.1 仪器 一次性全封闭无菌集菌过滤器(北京牛牛基因科技有限公司)、WJ-6无菌检查仪(天津罗根科技)、303A-1生化培养箱(上海浦东荣丰科学仪器有限公司)、SPX-100B生化培养箱(上海悦丰仪器仪表有限公司)。

1.2 试药 营养琼脂培养基(批号：140308), 玫瑰红钠琼脂培养基(批号：140228), 营养肉汤培养基(批号：130521),改良马丁培养基(批号：1401222), 改良马丁琼脂培养基(批号：130910), 硫乙醇酸盐流体培养基(批号：1401152), 0.1%蛋白胨水溶液(批号：110221)。以上均来源于北京三药科技开发公司。复方萘甲唑啉滴眼液(规格：10ml/瓶, 批号：201310228、201310238、201401178, 中山大学孙逸仙纪念医院 )。

1.3 菌种 大肠埃希菌(escherichia coli)［CMCC(B)44 102］,枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)［CMCC(B)63 501］, 金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)［CMCC(B)26 003］, 生孢梭菌(clostridum sporogens)［CMCC(B)64 941］, 白色念珠菌(candida albicans)［CMCC(F)98 001］, 黑曲霉(aspergillus niger)［CMCC(F)98 003］, 铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)［CMCC(B)10 104］(以上菌种的冻干菌均购自中国食品药品生物检定研究院 )。

2 方法与结果

2.1 菌液制备 取经30～35℃培养18～24 h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的肉汤培养物和生孢梭菌硫乙醇酸盐液体新鲜培养物, 取经23～28℃培养24～48 h的白色念珠菌液体培养物, 分别用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每毫升含菌数<100 cfu的菌悬液。取经23～28℃ 培养1周的黑曲霉斜面培养物, 加入3～5 ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液, 将孢子洗脱。然后, 用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内, 用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每毫升含孢子数<100 cfu的孢子悬液。

2.2 最少检验数量、检验量的确定 供试品的装量为10 ml,按《中国药典》2010版二部附录Ⅺ H无菌检查法, 结果见表1,最少检验数量应为10个；按表2, 每支供试品接入每种培养基的最少量为2 ml。

2.3 供试品管的制备 取供试品30支(批号：201310228、201310238、201401178)分2份, 15支/份, 用两套一次性三联管全封闭无菌集菌过滤器, 先用少量0.1%无菌蛋白胨水溶液湿润滤膜, 调节集菌仪转速为160 r/min, 按薄膜过滤法全量过滤, 每膜用0.1%无菌蛋白胨水溶液300 ml分3次冲洗 , 在最后50 ml冲洗液中加入菌液1 ml［2］, 过滤至干 , 作为供试品管。

2.4 对照管的制备 取过滤器, 加入50 ml 0.1%无菌蛋白胨水溶液, 加入相应的菌液1 ml, 滤干, 作为对照管。

2.5 无菌检查方法的验证 分别取含大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌和生孢梭菌的供试品管, 各加入硫乙醇酸盐流体培养基100 ml；含白色念珠菌和黑曲霉的供试品管, 各加入改良马丁培养基100 ml, 置相应培养温度培养。取对照管6管, 其中4管分别加入硫乙醇酸盐流体培养基100 ml, 再分别加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌和生孢梭菌菌液各1 ml；另2管分别加入改良马丁培养基100 ml, 再分别加入白色念珠菌和黑曲霉菌液各1 ml,置相应培养温度培养。同时, 取上述菌液各1 ml, 按微生物限度检查法(平皿法)(中国药典2010版二部附录Ⅺ H)计数,每个菌株平行制备2个平皿, 生孢梭菌用硫乙醇酸盐流体培养基作液体计数, 测定所加菌数。结果见表1。

表1 验证结果

3 小结

由于复方萘甲唑啉滴眼液处方中含有羟苯乙酯和硼酸,均有抑菌作用, 因此实验初始冲洗量选择了300 ml。由表1结果可见, 与对照管比较, 供试品管中的试验菌均生长良好,说明供试品在薄膜过滤法的检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计, 可照此检查方法和检查条件进行复方萘甲唑啉滴眼液的无菌检查。

［1］国家药典委员会.中国药典(二部).中国医药科技出版社,2010：附录XI H.

［2］张新妹, 胡昌勤, 赵霞, 等.注射用伏立康唑无菌检查法的建立.天津药学, 2003, 15(5):9-11.