补肾健脾中药对骨质疏松症小鼠骨骼、骨骼肌异柠檬酸脱氢酶影响的研究＊

李 佳，杨 芳，郑洪新△，王拥军

(1.辽宁中医药大学基础医学院，沈阳 110847;2.上海中医药大学脊柱病研究所骨代谢疾病研究室，上海 200032)

骨质疏松(osteoporosis)是以骨组织显微结构受损、骨矿成分和骨基质等比例不断减少、骨质变薄、骨小梁数量减低、骨脆性增加的一种全身骨代谢障碍疾病。骨质疏松症不仅会引发腰背酸痛、乏力、肢体麻木等不适症状，更使骨折发生的几率增高，降低人们生活质量。

本实验通过检测骨质疏松症小鼠骨骼、骨骼肌异柠檬酸脱氢酶的变化，以观察骨骼肌收缩与骨骼协调性对骨质疏松症形成的影响，从而阐释骨质疏松症“骨肉不相亲”的病理机制。同时，通过比较和观察补肾、健脾、活血法干预后对异柠檬酸脱氢酶的效应，探讨中医防治骨质疏松症的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物、环境及饲料

8周龄OPG基因敲除小鼠36只(品系C57BL/6J)，由上海中医药大学附属龙华医院脊柱病研究所引进。另设正常C57BC小鼠8只作为正常组，普通饲料喂养，体质量18～20 g，饲养条件为2级，室温保持在22～24℃，相对湿度50%。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂 异柠檬酸脱氢酶试剂盒由美国ADL公司提供(生产批号为79782)。

1.2.2 仪器 微孔板酶标仪(型号为550，美国伯乐公司)。

1.3 药物

补肾中药由淫羊藿、活性马鹿茸、牡蛎组成;健脾中药为补中益气颗粒，由北京汉典制药有限公司提供(生产批号为090101);对照药福善美，由杭州默沙东制药有限公司提供(生产批号为J20080073)。

1.4 造模及给药

1.4.1 造模 小鼠护骨素(OPG)基因敲除后，喂养6周，经双能X线骨密度仪测小鼠骨密度，确定小鼠造模成功。

1.4.2 分组 除正常组外，将OPG基因敲除小鼠按随机数字表法分为模型对照组(模型组)、补肾中药组(补肾组)、健脾中药组(健脾组)、活血化瘀中药组(活血组)和对照药组(福善美组)5组。

1.4.3 给药方法 正常组、模型组给予生理盐水0.5 mL;补肾组、健脾组、福善美组用药量按成人与小鼠的体质量折算系数9.01折算(成人体质量按60 kg计算)，容积为1 mL/100 g体质量，补肾组给药量为鹿茸0.32 g/kg/d，牡蛎0.256 g/kg/d，淫羊藿0.126 g/kg/d;健脾组给药量0.901 g/kg/d，福善美给药量1.5016 mg/kg/d。实验期间，各组小鼠每周称重1次，并根据体质量变化调整给药剂量。

1.5 标本采集及检测

实验小鼠最后1次灌胃后，禁食24 h，经10%水合氯醛注射麻醉(0.3 mL/100 g体质量)后用碘伏消毒手术部位，剪开腹腔后立即取出大鼠右后肢腓肠肌的白肌部分和左后肢全股骨。将骨骼、骨骼肌分别放入约5倍于组织体积量的MSH缓冲液中清洗、擦干、称重后，用剪刀剪碎置入匀浆瓶中;以500 rpm匀浆充分，将匀浆后的组织放入离心管中离心2000×g 10 min;提取上清液放入1 mLEP管中。具体检测步骤按试剂盒说明书进行。

1.6 统计学方法

采用SPSS 10.0软件进行统计分析，选用单因素方差分析，数据以均数±标准差(±s)表示，P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 中医不同治法对骨保护素基因敲除小鼠骨骼肌中异柠檬酸脱氢酶含量影响比较

表1显示，骨保护素基因敲除小鼠骨骼肌异柠檬酸脱氢酶检测结果显示，与正常组比较，其他各组小鼠骨骼肌的异柠檬酸脱氢酶显著降低(P＜0.01);与模型组比较，补肾组、福善美组小鼠骨骼肌的异柠檬酸脱氢酶明显升高(P＜0.01);健脾组升高程度也比较明显，但与模型组比较差异无统计学意义，活血组统计学角度无改变。

2.2 中医不同治法对骨保护素基因敲除小鼠骨骼中异柠檬酸脱氢酶含量影响比较

表1 各组小鼠骨骼肌中异柠檬酸脱氢酶含量比较(±s)

表1 各组小鼠骨骼肌中异柠檬酸脱氢酶含量比较(±s)

注:与正常组比较:*P＜0.01;与模空组比较:▲P＜0.01;与补肾组比较:#P＜0.01

组别 小鼠数 异柠檬酸脱氢酶浓度(mg/L)16.363±1.92模型对照组 8 5.521±0.44*补肾中药组 7 9.888±1.06＊▲健脾中药组 7 6.021±0.49*#福 善 美 组 7 12.482±1.31正常组8＊▲

表2显示，骨保护素基因敲除小鼠骨骼异柠檬酸脱氢酶检测结果显示，与正常组比较，模型组、补肾组、健脾组和活血组小鼠骨骼的异柠檬酸脱氢酶显著降低(P＜0.01)，福善美组与正常组比较差异无统计学意义(P＞0.01);与模型组比较，补肾组、福善美组小鼠骨骼的异柠檬酸脱氢酶明显升高(P＜0.01);健脾组升高程度也比较明显，但与模型组比较差异无统计学意义;活血组统计学角度无改变。

表2 各组小鼠骨骼中异柠檬酸脱氢酶含量的比较(±s)

表2 各组小鼠骨骼中异柠檬酸脱氢酶含量的比较(±s)

注:与正常组比较:*P＜0.01;与模型组比较:▲P＜0.01;与补肾组比较:#P＜0.01

组别 小鼠数 异柠檬酸脱氢酶浓度(mg/L)16.329±1.01模型对照组 8 5.161±0.28*补肾中药组 7 9.767±0.74＊▲健脾中药组 7 5.563±0.38*#福 善 美 组 7 17.321±1.47正常组8＊▲

3 讨论

3.1 骨骼与肌肉的失调性对骨质疏松症影响

骨骼为肌肉提供附着部位，肌肉收缩带动骨骼完成动作，两者相互协同，构成骨骼和肌肉系统，实现构成形体、支撑质量、保护内脏、运动等作用。有研究表明，肌肉力量和紧张度变化可作为临床骨质疏松症形成与否的前瞻指标［1］。中医学认为“肾主骨”、“脾主肌肉四肢”，《内经》中充分论述和强调肾与骨、脾与肌肉的关系，可见先天之本(肾)与后天之本(脾)在骨骼、肌肉生理和病理过程中发挥着决定性影响和作用。而水土两脏“先天之本”与“后天之本”的相互联系，也蕴含和表现在其各自所主的器官(骨骼和肌肉)之间，亦即“骨不濡则肉不能著也，骨肉不相亲则肉软却”之意。

3.2 异柠檬酸脱氢酶标识的肌肉状态与骨质疏松症的关系

人体肌肉运动的过程伴随着能量代谢的过程，为获取肌肉活动所需要的能量，机体任何轻微的活动都可提高代谢率，而获取肌肉活动所需能量的主要方式即为三羧酸循环。异柠檬酸脱氢酶是三羧酸循环过程中重要的调节酶之一，在能量代谢和生物合成代谢过程中发挥着重要作用。其活性在骨骼肌组织中表达越高，说明能量代谢越旺盛［2］。研究表明，异柠檬酸脱氢酶在线粒体中受Ca2+调节，亦有研究表明，Mg2+浓度对其受Ca2+影响的敏感性有至关重要的作用。［3］

3.3 补肾健脾中药对骨质疏松症的防治作用

骨质疏松症属于中医“骨痿”、“骨痹”范畴，髓道空虚，骨空、骨虚而不坚首当责之于肾，肾精亏虚，不足以荣养骨及骨髓，导致骨质疏松。在“肾藏精”、“肾主骨生髓”理论指导下，本研究补肾组用药选用郑洪新教授多年科研及临床实践总结的补肾填精中药复方鹿茸、牡蛎、淫羊藿，通过补肾填精，精足则髓满，髓实则骨充。肾精源于先天之精，又由后天之精的不断充养，因此肾精不足亦与后天脾胃化生功能密切相关。本研究选用补益脾胃的代表方剂补中益气颗粒，在OPG敲除小鼠体内观察健脾方药的治疗效果。结果表明，补肾填精中药和健脾中药对骨骼及骨骼肌中异柠檬酸脱氢酶的表达都有不同程度的影响，提示先天之精和后天之精共同维持肾中精气的充盛与否，进而调节骨的代谢状态，值得临床治疗借鉴和参考。另一方面，“肾主骨”、“脾主肌肉”，通过调节骨骼和肌肉的协调性，也对临床治疗骨质疏松症有积极的指导意义。

本实验结果显示，骨质疏松症模型小鼠骨骼、骨骼肌的异柠檬酸脱氢酶浓度均与正常组比较显著降低，说明骨质疏松症形成后，骨骼、骨骼肌功能下降，能量代谢显著降低。观察中医不同治法对纠正骨质疏松症的影响，补肾方法能显著提高骨骼、骨骼肌的异柠檬酸脱氢酶浓度，说明补肾法能显著改善骨质疏松症小鼠骨骼和骨骼肌运动和功能状态，维持相对较高水平的能量代谢。健脾组实验结果显示，骨骼、骨骼肌的异柠檬酸脱氢酶浓度有所提高，虽与模型组比较差异无统计学意义，但可以看出健脾方法有提高骨骼、骨骼肌异柠檬酸脱氢酶浓度的趋势。活血组异柠檬酸脱氢酶与模型组比较差异无统计学意义，对骨质疏松小鼠骨骼和骨骼肌功能无改善。本实验与前期实验研究结果一定程度证实，补肾法能够有效改善和维持骨质疏松症患者骨骼和肌肉的功能，有效防止肌肉萎缩，预防骨折的发生。临床应用健脾法可作为补肾法的辅助用药，以濡养肌肉，促进骨生成，协助补肾中药改善预防和治疗骨质疏松症。

［1］ToniRikkonen， Joonas Sirola ， KariSalovaara， Marjo Tuppurainen， Jukka S. Jurvelin， Risto Honkanen， Heikki Kr9ger，-Muscle Strength and Body Composition Are Clinical Indicators of Osteoporosis［J］.Calcif Tissue Int，2012，91:131-138.

［2］Korinna Huber，Johanna Petzold，Charlotte Rehfeldt，Klaus Ender，Ilse Fiedler，-Muscle energy metabolism:structural and functional features in different types of porcine striated muscles［J］.J Muscle Res Cell Motil，2007，28:249-258.

［3］G.A.Rutter，R.M.Denton，Rapid purification of pig heart NAD+-isocitrate dehydrogenase-Studies on the regulation of activity by Ca2+，adenine nucleotides，Mg2+and other metal ions［J］.Biochem.J，1989，263(2):445-452.