灭幽汤对幽门螺杆菌相关性胃炎脾胃湿热证小鼠 AQP4、IL-6、IL-8 的影响*

郭 璇 罗 燕喻 斌 王小娟△ 杜中华 夏 蓉 尹 姣

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

脾胃湿热证是慢性胃炎中最常见的实证，幽门螺杆菌（Hp）是导致胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌的主要致病因子［1-2］。水通道蛋白（AQPs）作为在多种器官组织的细胞膜上存在着的一种整合蛋白质，可控制水在细胞的进出，在机体水液转运和代谢中发挥重要作用。水通道蛋白4（AQP4）是AQPs蛋白家族成员之一，在化学诱导损伤胃黏膜后，AQP4在维持胃黏膜完整性中起重要作用［3］。灭幽汤是临床治疗Hp相关性脾胃湿热型慢性胃炎的经验方［4-8］。本研究通过施加湿热生存环境、Hp细菌感染、肥甘饮食的方法复制脾胃湿热证BALB/c小鼠模型，从AQP4、白介素 （IL）-6、IL-8方面探讨灭幽汤治疗Hp相关性脾胃湿热型慢性胃炎的机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级BALB/c小鼠70只，雌雄各半，8周龄［购自南京君科生物科技有限公司，质量合格证号：0017145，动物中心许可证号：SCXK（苏）2011-0003］。饲料：普通饲料由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，高脂饲料（普通饲料+8%蜂蜜+12%猪油）由湖南斯莱克景达实验动物有限公司代加工。

1.2 Hp菌种 悉尼标准菌株 （SSI），SSI含有细胞毒素相关基因（cagA）蛋白和空泡细胞毒素（vacA），浓度为Hp菌液1×109cfu/mL，由湖南中医药大学基础医学院病原免疫学教研室提供。

1.3 药物 灭幽汤（黄芩、蒲公英、三七、白及、青皮、陈皮、乌贼骨），以上药材均购于湖南省药材公司饮片加工厂，经湖南中医药研究院鉴定，符合药典标准；药物浸泡30min后，加水没过药面5 cm，武火煎至沸腾后改文火，继续煎煮20min，取汁另置。继续加水，煎煮沸腾后，文火续煎20min，取汁。两次药汁合并后浓缩至每毫升含生药2 g，并用离心机去除药汁中残渣，4℃保存。枸橼酸铋钾由丽珠医药出厂，生产批号：1212248。替硝唑由山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司出厂，国药准字H20033090，生产批号121004。克拉霉素由杭州中美华东制药有限公司出厂，国药准字H10970216，生产批号121101。

1.4 仪器与试剂 胶体金法幽门螺杆菌检测试剂盒，艾康生物技术（杭州）有限公司生产，批号：20123139。AQP4一抗购自武汉博士德生物工程有限公司，编号：BA1560，二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司编号：SP9002。JY3002型电子天平购自上海精密科学仪器有限公司，HHS-2电子恒温不锈钢水浴锅购自上海南阳仪器有限公司，LEICADM LB2型双目显微镜购自德国LEICA公司，Shandon325型石蜡切片机英国Shandon公司产，DNP-9162型电热恒温培养箱购自上海精宏实验设备有限公司，Motic B5显微摄像系统购自麦克奥迪实业集团公司，人工湿热箱为本实验室制作（现已申请专利）。

1.5 分组与造模 将70只BALB/c小鼠随机分为灭幽汤高浓度组（灭高组）、灭幽汤低浓度组（灭低组）、胃三联组、模型组、正常对照组。正常对照组予以普通饲料饲养，灭高组、灭低组、胃三联组、模型组造模方法综合廖莹峰等对脾胃湿热模型及Hp感染动物模型的报道建立［9-11］：予以高脂饲料饲养10 d后放入人工湿热箱［温度（32±2） ℃，湿度（95±1）%］内，继续高脂饲料喂养，于放入人工湿热箱后的第15日以浓度为1×109cfu/mL Hp混悬液0.3 mL/只灌胃。灌胃前24 h禁食不禁水，灌胃前4 h禁水，灌胃后4 h给食水。隔日感染1次，连续感染3次，感染后定植2周。2周后各组随机抽取2只小鼠做病理切片观察炎症情况，模型组另取2只小鼠以胶体金法检测血浆Hp抗体，做电镜下观察Hp定植情况。

1.6 给药方法 灭高组、灭低组、胃三联组在模型造模成功后开始给药，按照小鼠与人体表面积计算比值换算公式，计算小鼠用药剂量。胃三联组予替硝唑+克拉霉素+枸橼酸铋钾颗粒，用药剂量为279.8 mg/kg；灭高组予灭幽汤，剂量为12.4 g/kg；灭低组予灭幽汤，剂量为6.2 g/kg。每日灌胃1次，其他组分别灌等量的蒸馏水。

1.7 标本采集与检测 给药后两周摘眼球取血，Elisa检测血清中IL-6、IL-8的含量。再脱颈处死小鼠，将小鼠仰卧位固定于鼠板，迅速取出胃标本。取胃前，将幽门部和贲门部结扎，在两结扎线的两端切断食道及十二指肠，摘下全胃。沿胃大弯剖开，用冰生理盐水冲洗干净，放入40 g/L多聚甲醛中4℃固定24 h，石蜡包埋，备做免疫组化检测。免疫组化法检测AQP4：蜡切片脱蜡水化，3%H2O2室温孵育10min，蒸馏水洗3次；枸橼酸盐缓冲液（pH=6.0）高压煮沸，蒸馏水冲洗，PBS洗涤2次，每次5min；山羊抗血清封闭15min；加入AQP4一抗，4℃，过夜；PBS漂洗3次，每次5min；加入SABC，室温孵育2 h，PBS漂洗3次，每次5min；显色液显色，镜下观察，待显色完全后清洗，终止显色反应；滴加苏木素复染，流水漂洗，梯度酒精脱水、二甲苯透明、树脂胶封片。使用CMIAS真彩色病理图像分析系统对样本图像进行分析。每个样本随机选取3个高倍视野，计算黄褐色阳性表达的面密度（阳性表达总面积/统计区域总面积）表示，以此表示AQP4蛋白的表达，进行半定量分析。

1.8 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（）表示，符合正态性和方差齐性的资料，应用完全随机化设计的方差分析、多重比较，不符合正态性和方差齐性，用秩和检验Kruskal-Wallis H检验，两组比较用Wilcoxon检验和Mann-Whitney U检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 造模结果 本研究从病因模拟建立Hp相关性胃炎脾胃湿热证模型，从小鼠饮食、饮水、大小便及精神状态结果分析，本实验造模方法成功使模型组小鼠表现出食少纳呆、少饮、大便溏、肢体困重等脾胃湿热证症状，与2002年《中药新药临床研究指导原则》中脾胃湿热证辨证依据相符。光镜下模型组小鼠胃黏膜多为充血肿胀，表面欠光整，腺体排列较紊乱，可见较多的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞浸润，未见糜烂，模型组符合慢性非萎缩性胃炎表现。综上所述，湿热环境、肥甘饮食及Hp定值综合病因制造的脾胃湿热证动物模型典型，在症状表现、病理检查及验方反证上均贴近临床，造模方法可行。

2.2 各组小鼠胃组织病理改变 见图1。光镜下，正常组小鼠胃黏膜上皮细胞排列整齐，细胞呈单柱状，固有层内有密集排列的腺体，个别小鼠胃黏膜底部可见少量散在的淋巴细胞。模型组小鼠胃窦部的炎症程度重，胃黏膜上皮排列紊乱，固有层内可见大量淋巴滤泡、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞浸润，炎症细胞甚至到达黏膜下层。灭低组炎症程度明显减轻，黏膜层少量炎性细胞浸润，固有层仅有水肿，少量淋巴细胞。灭高组和胃三联治疗组胃黏膜上皮细胞排列整齐，炎症几乎全部消失。

图1 各组小鼠胃组织病理改变

2.3 各组小鼠胃黏膜AQP4、血清IL-6、IL-8表达变化 见表1。（1）AQP4的表达：与正常对照组比较，小鼠模型组AQP4表达增加（P＜0.01）；与模型组比较，灭高组、灭低组、胃三联组小鼠AQP4表达降低，差异均有统计学意义 （P＜0.01）。胃三联组与灭高组中AQP4 降低，差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）血清 IL-6、IL-8表达：对照组小鼠血清中有极少量IL-6、IL-8表达。与正常对照组比较，模型组IL-6、IL-8表达增加（P＜0.01）；与模型组比较，灭高组、灭低组、胃三联组小鼠IL-6、IL-8表达均明显降低（P＜0.01）；高灭组 IL-6、IL-8低于灭低组（P＜0.05），说明灭幽汤质量浓度影响其疗效；灭高组IL-6、IL-8低于胃三联组 （P＞0.05）。

3 讨 论

中医学认为脾主运化水谷精微，为津液代谢的枢纽，脾胃运化水液功能失司，易致湿浊内生，湿聚日久化热，是脾胃湿热证的基本病机之一。而Hp是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的细菌，具有极强的运动能力。强动力性是Hp致病的重要因素。现代中医通过临床和实验研究发现Hp和脾胃湿热证在慢性胃炎的发生中起相辅相成的作用，Hp感染和脾胃湿热证之间密切相关，Hp阳性的慢性胃炎患者中以脾胃湿热证为最多［12］。有研究［13］认为慢性胃炎脾胃湿热证 Hp感染率高，Hp可损害胃黏膜屏障，湿热之邪与Hp在病因学上是同一致病原，Hp具有类似湿热病邪的致病特点（隐匿性、渐进性、反复性、迁延性），胃内“湿热”环境有利于Hp的生存。

表1 各组小鼠胃黏膜组织AQP4、血清IL-6、IL-8表达水平比较（）

表1 各组小鼠胃黏膜组织AQP4、血清IL-6、IL-8表达水平比较（）

与正常对照组比较，△P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.01；与灭高组比较，#P＜0.05。

AQP是一种位于细胞膜上的高度保守的疏水性跨膜小分子整合蛋白，具有渗透量调节、运输生物前体、代谢废物等生理功能［14］。IL-6、IL-8等细胞因子在介导和调节免疫应答及炎症反应过程中起到重要作用，具有参与细胞免疫、炎症反应等过程，对炎症的发展起促进的作用。近年来发现AQP在机体水液转运和代谢中起重要作用，对维持机体内水平衡具有重要意义，是维持体内水液代谢平衡的分子学基础，为研究湿病的形成与防治提供了新思路［15］。有研究［16］从 AQP4表达变化探讨了脾胃湿热证的发生机理，并证明AQP4的异常表达是脾胃湿热证的发生机制之一。陈更新等［17-18］研究亦认为AQP3、AQP4的异常表达与脾胃湿热证的发生密切相关，并运用清热化湿方调节AQP3、AQP4的表达发挥治疗作用，治疗慢性胃炎脾胃湿热证。

本研究表明在湿热环境和Hp等双重因素的刺激下，可增加AQP4的释放，刺激炎症因子IL-6、IL-8的表达；给予清热祛湿的中药汤剂灭幽汤AQP4、IL-6、IL-8的表达明显降低，说明灭幽汤可能通过调节AQP4、IL-6、IL-8的表达，减轻了胃黏膜的充血水肿等炎症反应，从而达到治疗Hp相关性脾胃湿热型慢性胃炎的目的。

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