犬细小病毒胶体金检测试纸条的制备与初步评价

刘 洁，牟林琳，何文辉，李晶梅，谢红玲，廖园园，朱 薇，漆世华，温文生

(武汉中博生物股份有限公司，武汉430070)

犬细小病是由犬细小病毒(CPV)引起的一种急性、以出血性肠炎或非化脓性心肌炎为主要特征的犬科和鼬科动物的重要传染病［1］。我国已建立的用于检测CPV抗体的血清学方法有血凝试验、血凝抑制试验、琼脂扩散试验等，但是由于CPV与猫泛白细胞减少症病毒、水貂肠炎病毒三者之间能发生交叉血清学反应，因此在实际应用中这些方法常受到限制。酶联免疫吸附试验(ELISA)可检测CPV抗原，也可检测CPV抗体;PCR检测敏感性高，特异性强，可分辨野毒感染和疫苗免疫，但这两种技术都需要特殊的仪器设备。利用胶体金标记单克隆CPV表面抗体，制成检测CPV抗原的胶体金检测试纸条敏感性高，特异性强，稳定性好，操作简便快速，结果易于分析判定［2］。

本研究利用胶体金免疫层析技术，成功研制出犬细小病毒胶体金免疫层析快速检测试纸条，对CPV抗原的快速检测对防控该病及流行病学调查有较大的辅助作用。

1 材料与方法

1.1 材料 氯金酸购自天津光复精细化工研究所;柠檬酸三钠购自AMRESCO;抗犬细小病毒单抗(CPV－F1和CPV－B6)由武汉中博生物股份有限公司制备保存［3］;羊抗小鼠IgG二抗购自博士德公司;样品垫、金标垫、NC膜购自上海捷宁生物科技有限公司;犬细小病毒(CPV)，VR－2209和犬瘟热病毒(CDV)，VR－1587购自ATCC;犬用狂犬病毒灭活苗购自英特威;5份犬细小病毒抗原样品(血凝试验检测阳性)、10份健康犬粪便样品(血凝试验检测阴性)均采自宠康动物诊所接诊宠物狗，60份与进口商品化犬细小病毒抗原检测试纸对比样品由宠康动物诊所提供;韩国进口试纸条购自韩国安捷，货号RG11－01。

1.2 方法

1.2.1 犬细小病毒抗原检测试纸条的制备［4］

1.2.1.1 胶体金的制备 采用柠檬酸三钠还原法［4］制备粒径为25 nm的胶体金溶液。

1.2.1.2 胶体金的标记 量取胶体金溶液20 mL，调pH值至9.0，搅拌加入抗犬细小病毒单克隆抗体CPV－F1 0.08 mg搅拌30 min，再加入终浓度20%的PEG－20000稳定未结合的胶体金颗粒，8700 r/min离心30 min，弃上清，再用金标缓冲溶液定容至2 mL，4℃保存备用。

1.2.1.3 金标垫的制备 标记好的胶体金溶液均匀涂布于金标垫上，37℃烘干2 h备用。

1.2.1.4 质控线和检测线的包被 将羊抗小鼠IgG二抗和抗犬细小病毒单克隆抗体CPV－B6分别包被于硝酸纤维素膜作为质控线和检测线，37℃烘干2 h备用。

1.2.1.5 犬细小病毒抗原检测试纸的制备 将制备好的硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫和吸水纸依次粘贴于背衬板上，切条机切割成4 mm条，装入卡壳，封装于装有干燥剂的铝箔袋中。2～28℃保存备用［5］。

1.2.2 样品检测和判定标准［6］将沾有犬粪便的取样棉签插入稀释液中搅拌均匀，静置片刻取上清液(80～120 μL，滴管 3～4滴)缓慢滴加到加样孔中，将试纸卡平放，10 min观察结果。判定标准如图1:若在试纸条上出现两条红色的条带(检测线和质控线)，则为阳性结果。若在试纸条上只在质控线处出现一条红色的条带则为阴性结果。若质控线处不出现红色的条带则试纸失效。

1.2.3 阳性参考样品的制备［3］犬细小病毒(VR－2209)接种到已长成单层的 F81细胞上，37℃培养72 h后，收取培养液。加入1%硫柳汞，使其终浓度为0.01%，加入二乙烯亚胺(BEI)使其终浓度为5 mmol/L，37℃灭活16 h，加入终浓度5 mmol/LNa2S2O3中和 BEI，10000 r/min 2 ～8 ℃离心30 min，去除细胞碎片，取上清液。将上述上清液分装1 mL/支，－70℃保存备用。

图1 犬细小病毒抗原检测胶体金试纸条结果判定示意图

1.2.4 试纸条质量的评估［7］

1.2.4.1 特异性 用制备好的犬细小病毒抗原检测试纸条检测5份犬细小病毒抗原样品、10份健康犬粪便样品、犬瘟热病毒样品1份、狂犬病毒灭活疫苗样品1份。观察检测结果。

1.2.4.2 敏感性 将犬细小病毒阳性参考样品做22～215倍比稀释，用制备好的犬细小病毒抗原检测试纸条进行检测，同时将同一阳性参考样品做21～212倍比稀释，做病毒血凝试验(HA)［8］作为对照，评价试纸条的敏感性。

1.2.4.3 与进口商品化犬细小病毒抗原检测试纸的符合率 对60份待检样品分别用制备的犬细小病毒抗原检测试纸条与韩国进口犬细小病毒检测试纸条同时进行检测。

2 结果

2.1 特异性试验 结果见图2。犬细小病毒检测试纸条检测5份犬细小病毒阳性粪便样品均为阳性，检测10份健康犬粪便样品均为阴性，同时不与犬瘟热病毒和狂犬病毒发生交叉反应，说明有较好的特异性。

图2 特异性检测结果

2.2 敏感性试验 本研究试纸条检测阳性参考样品最低稀释度为211(图3)，而血凝试验检测到阳性参考样品的血凝价为210(图4)，两种检测结果表明犬细小病毒检测试纸条比血凝试验敏感性高一倍。

2.3 符合率试验 同时用本研究制备的犬细小病毒抗原检测试纸条和韩国进口的犬细小病毒检测试纸条对60份待检样品中的犬细小病毒进行检测，结果(表1)表明，两试纸条对待检样品的阳性符合率为100%，阴性符合率为97.5%，总符合率为98%。

图3 试纸条敏感性试验结果

图4 间接血凝试验结果

表1 两种试纸条检测样品对比结果

3 讨论

本研究制备的试纸条与HA检测同一阳性样品，检测结果比HA高一倍，且操作简单、快速;与韩国进口的试纸条进行符合率检验，结果表明阳性符合率为100%，阴性符合率为97.5%，有一个阴性不符合的结果，但经PCR检测，该样品的检测结果为阳性，推测该样品含有的病毒量较低。

犬细小病毒病是犬常见疾病，快速、准确的诊断该病为治疗该病提供有利的参考依据。胶体金免疫层析试纸条是目前确诊该病的主要诊断方法，一般宠物医院都会选用进口产品。本研究制备的犬细小病毒抗原胶体金检测试纸条具有敏感性高、特异性好等特点，对比进口产品符合率也较高，可替代进口产品使用，降低诊断成本，也可用于流行病学调查，为消除该疾病提供有效的辅助手段。

［1］ 殷 震，刘景华.动物病毒学［M］.第2版，北京:科学出版社，1997:736－750.

［2］ Pratelli A，Cavalli A，Martella V，et al.Canine parvovirus(CPV)vaccination:comparison of neutralizing antibody responses in pups after inoculation with CPV2 or CPV2b modified live virus vaccine［J］.Virology，2001，8(4):612 －615.

［3］ 刘 洁，何文辉，李晶梅，等.分泌抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立［J］.中国兽药杂志，2013，47(7):9－12.

［4］ 刘文俊，王仲兵，郑明学，等.免疫层析快速诊断试纸条的制备及在动物疾病诊断中的应用［J］.畜牧兽医科技信息，2009，11:8－10.

［5］ 刘 洁，夏兴霞，王永山，等.大肠杆菌O157:H7抗体胶体金免疫层析检测试纸条的研制［J］.中国预防兽医学报，2010，32(5):375－378.

［6］ 刘宏伟，邱旭方，王俊朝，等.犬细小病毒胶体金免疫层析快速诊断试纸条的研制［J］.中国养犬杂志，2002，2(13):18－20.

［7］ 孙 洋，冯书章，郭学军，等.肠出血性大肠杆菌O157胶体金免疫层析试纸条的研制［J］.中国人兽共患病学报，2008，24(4):356－359.

［8］ 秦海斌，张汇东，缪 勤，等.犬细小病毒血凝的检测和血凝抑制试验方法的优化［J］.中国比较医学杂志，2009，19(7):49－52.