RAS信号途径参与干扰素-α抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖

龙向淑，吴 强，宋 方，黄 晶，张林军

(贵州省人民医院 心血管内科，贵州 贵阳550002)

RAS信号途径参与干扰素-α抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖

龙向淑，吴 强*，宋 方，黄 晶，张林军

(贵州省人民医院 心血管内科，贵州 贵阳550002)

目的探讨RAS信号途径在干扰素-α(IFN-α)抑制大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖中的作用。方法应用转染IFI204 siRNA和/或IFN-α瞬时干预体外培养的大鼠VSMCs，以非特异性siRNA转染组为对照组，用MTT法测定细胞活力，流式细胞仪分析细胞周期，RT-PCR 法和Western blot分别检测P204 mRNA、P204和Ras蛋白的表达及RAF与ERK的磷酸化水平。结果与对照组比较，IFN-α组P204 mRNA和蛋白表达上调(Plt;0.01)，细胞活力和细胞周期G1/S转换下调(Plt;0.01)，伴RAS蛋白表达减少(Plt;0.01)，RAF及ERK磷酸化水平下降(Plt;0.01)；转染IFI204 siRNA后再加IFN-α干预，P204 mRNA及蛋白表达下调(Plt;0.01)，而G0/G1期细胞增多，S期细胞减少(Plt;0.01)，且RAS蛋白表达和RAF及ERK磷酸化水平亦下调(Plt;0.01)。结论RAS信号途径参与IFN-α抑制大鼠VSMCs增殖。

干扰素；血管平滑肌细胞；增殖；干扰素诱导蛋白；P204；RAS信号途径

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)迁移、增殖及分泌细胞外基质，使血管内膜增生是血管成形术后再狭窄、动脉粥样硬化及高血压等血管增殖性疾病发病的主要机制，有效抑制VSMCs增殖，对上述疾病的防治具有重要意义。干扰素-α(Interferon alpha, IFN-α)可诱导P204表达而抑制大鼠VSMCs及血管外膜成纤维细胞增殖[1- 3]。本研究进一步探讨IFN-α抑制大鼠VSMCs增殖的可能机制，为其临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂(盒)

清洁级SD大鼠(雌性1只，雄性2只)，年龄约5周龄，体质量120 ～140g[第三军医大学实验动物中心，合格证号：SCXK(渝)2012-0003]。IFN-α(北京三元基因工程有限公司)；DMEM高糖型细胞培养液和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(Hyclone公司)；α-SMA单克隆抗体(BM0002)、即用型SABC试剂盒和DAB显色试剂盒(武汉博士德公司)；四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT](Sigma 公司)；细胞周期检测试剂盒(C1052)和Tubulin抗体(碧云天公司)；Trizol 总RNA提取试剂(DP405)、2×Taq PCR MasterMix (KT201)和100 bp DNA Ladder(北京天根公司)；RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)；PCR扩增引物由大连宝生物工程有限公司合成(表1)；P204抗体(Santa Cruz公司)；RAS、p-RAF及p-ERK 44/42抗体(Abcam公司)。

表1 引物序列Table 1 The sequences of primers

1.2 细胞培养及实验分组

按文献[4]的方法培养VSMCs。取4～6代细胞用于实验。实验分3组：非特异性siRNA转染组设为对照组(control)、IFN-α干预组(IFN)和IFI204 siRNA转染+IFN-α干预组(siRNA+ IFN)。IFN组用终浓度为2×106U /L IFN-α干预6 h，siRNA+IFN组先瞬时转染IFI204 siRNA干预6 h，后与IFN组同步加IFN-α干预6 h，继续培养48 h收集细胞。实验重复3次。

1.3 RT-PCR检测mRNA表达

按Trizol 总RNA提取试剂盒说明提取总RNA，取1 μg 按RT-PCR试剂盒说明书反转录合成cDNA，取产物3 μL进行PCR循环，PCR扩增条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃30 s，72 ℃ 1 min，扩增30个循环，最后72 ℃ 延伸5 min。反应结束后取PCR产物5 μL在2%琼脂糖凝胶中电泳分析，UVP800型凝胶成像系统成像。

1.4 Western blot检测蛋白表达

按文献[5]的方法检测蛋白表达。

1.5 MTT实验

收集对数增殖期细胞，按细胞数3×103个/孔接种于96孔板，按上述分组进行相应干预。培养板用平板离心机4 000r/ min离心5 min，吸尽上清液。每孔加入150 μL DMSO，置旋转摇床上低速振荡10 min，酶联免疫仪490 nm波长检测各孔吸光度A值。

1.6 流式细胞术检测细胞周期

按试剂盒(C1052)说明书检测细胞周期。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 干预因素对P204 mRNA和蛋白表达的影响

与对照组比较，IFN组P204 mRNA和蛋白表达增多，而siRNA+IFN组P204 mRNA和蛋白表达减少(Plt;0.01)；与IFN组比较，siRNA+IFN组P204 mRNA和蛋白表达减少(Plt;0.01)(图1，表2)。

control.control group; IFN.IFN-α induction group; siRNA+IFN.IFI204 siRNA transfaction and IFN-α induction group图1 干预因素对大鼠VSMCs P204 mRNA及蛋白表达的影响Fig 1 Effect of intervention factor on expression of P204 mRNA and protein in VSMCs in rats

2.2干预因素对RAS蛋白表达和RAF及ERK磷酸化水平的影响

与对照组比较，IFN组及siRNA+IFN组RAS蛋白表达减少，RAF及ERK磷酸化水平降低(Plt;0.01)；siRNA+IFN组与IFN组比较，上述指标无明显变化(图2，表2)。

2.3 IFN-α对VSMCs增殖及细胞周期的影响

与对照组比较，IFN组及siRNA+IFN组的MTT吸光度A值降低(Plt;0.01)(表2)；IFN组和siRNA+IFN组的G0/G1期细胞增多，S期细胞减少(Plt;0.01)(图3，表2)。

3 讨论

IFN具有抗病毒、抗增殖、影响细胞生长和分化及调节免疫应答等功能[6]。它与相应受体结合诱导一系列蛋白表达而发挥上述功能[7]。P204是IFN诱导蛋白P200家族的鼠类蛋白成员，其编码基因IFI204在鼠的心肌、骨骼肌、肾及成骨细胞等多种组织及细胞存在丰富表达[8- 9]。IFN的抗病毒及免疫调节功效已明确，而其抗增殖、促凋亡或存活、促进衰老和分化及抑制血管生成的作用及机制尚存在争议[6]。文献报道[1- 3]，在大鼠的主动脉外膜成纤维细胞和VSMCs，IFN-α可促进P204表达而抑制细胞增殖。

control.control group; IFN.IFN-α induction group; siRNA+IFN.IFI204 siRNA transfaction and IFN-α induction group图2 干预因素对大鼠VSMCs RAS蛋白表达和RAF及ERK磷酸化水平的影响Fig 2 Effect of intervention factor on expression of RAS protein and the phosphorylation levels of RAF and ERK in VSMCs in rats

本结果显示， IFN-α干预可降低VSMCs细胞活力，阻滞或延缓VSMCs细胞周期由G0/G1期进入S期，伴P204 mRNA和蛋白表达上调，进一步证实IFN-α可通过促进P204表达而抑制大鼠VSMCs增殖。除P204途径外，IFN-α是否尚存在其他影响VSMCs增殖的机制？ 生长因子介导的RAS信号传导途径是诸多信号途径中与细胞增殖、分化密切相关的重要信号途径之一。RAS、RAF为ERK活化的上游信号蛋白，RAS在细胞外信号刺激下，转化为激活型RAS，后者逐级磷酸化活化RAF及MEK，最终激活ERK。活化的ERK入核并启动相应转录子的转录。本文表明，单纯IFN-α干预可诱导P204 mRNA和蛋白表达上调，伴RAS蛋白表达减少，其下游信号蛋白RAF及ERK磷酸化水平相应下降，VSMCs增殖减少；转染IFI204 siRNA后再加IFN-α干预，P204 mRNA和蛋白表达减少，显示了IFI204 siRNA对P204在转录和转录后水平的抑制作用，而RAS蛋白表达及其下游信号蛋白RAF及ERK磷酸化水平亦下降，VSMCs活力降低，G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，提示抑制VSMCs P204表达对IFN-α下调RAS蛋白表达、降低RAF和ERK磷酸化水平及抑制VSMCs增殖的作用无明显影响，除P204途径外，IFN-α抑制VSMCs增殖尚与其抑制RAS信号途径的激活有关，IFN-α尚存在其他影响RAS信号途径活化的机制。

表2 干预因素对相关指标的影响Table 2 Effect of intervention factor on related target(±s, n=3)

*Plt;0.01 compared with control;#Plt;0.05 compared with IFN group.

control.control group; IFN.IFN-α induction group; siRNA+IFN.IFI204 siRNA transfaction and IFN-α induction group图3 干预因素对大鼠VSMCs细胞周期的影响Fig 3 Effect of intervention factor on cell cycle in VSMCs in rats

综上所述，IFN-α可抑制大鼠VSMCs增殖，该效应可能与IFN-α促进P204表达及抑制RAS信号途径的激活有关，但其具体机制有待进一步明确。

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RAS signal pathway participates in interferon-α mediated inhibition of proliferation of vascular smooth muscle cells in rats

LONG Xiang-shu, WU Qiang*, SONG Fang, HUANG Jing, ZHANG Lin-jun

(Dept. of Cardiology, Guizhou Province People’s Hospital, Guiyang 550002,China)

ObjectiveTo study the action of RAS signaling pathway in interferon alpha (IFN-α) mediated to inhibition proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) in rats.MethodsCultured VSMCs were treated with transfectionIFI204 siRNA and/or IFN-α. Nonspecific siRNA transfection group was as control group. The cell vitality was detected by MTT method, and the cell cycle was analyzed by flow cytometry. The expression of P204 mRNA was determined by semiquantitative RT-PCR. P204, RAS protein and the phosphorylation levels of RAF and ERK was analyzed by Western blot.ResultsCompared with control group, the expression of P204 mRNA and protein up-regulated(Plt;0.01), the cell vitality and the cell cycle of G1/S transition down-regulated(Plt;0.01). In the process of the above, the expression of RAS protein decreased(Plt;0.01) and the phosphorylation levels of RAF and ERK droped(Plt;0.01); When intervented with IFN-α after transfectionIFI204 siRNA, down-regulated the expression of P204 mRNA and protein were down-regulated(Plt;0.01), and cells of G0/G1stage increased and S stage decreased(Plt;0.01), but the expression of RAS protein and the phosphorylation levels of RAF and ERK did not increase correspondingly(Plt;0.01).ConclusionsRAS signal pathway participates in interferon-α mediated inhibition of proliferation of vascular smooth muscle cells in rats.

interferon; vascular smooth muscle cells; proliferation; interferon-inducible protein; P204; RAS signaling pathway

2013- 11- 25

2014- 01- 13

国家自然科学基金项目(81260030)；贵州省优秀科技教育人才省长专项资金 [黔省专合字(2009)30号]

*通信作者(correspondingauthor)： gzgywq@126.com

1001-6325(2014)07-0882-04

研究论文

R 363

A