miR-30a表达载体构建、病毒包装和表达活性的检测

刘 玥，帅 春，尹 虹，宋艳斌*，马文丽*

(1.南方医科大学 基因工程研究所， 广东 广州 510515; 2.广东省妇幼保健院 新生儿科 越秀院区， 广东 广州 510000)

miR-30a表达载体构建、病毒包装和表达活性的检测

刘 玥1，帅 春2，尹 虹1，宋艳斌1*，马文丽1*

(1.南方医科大学 基因工程研究所， 广东 广州 510515; 2.广东省妇幼保健院 新生儿科 越秀院区， 广东 广州 510000)

目的构建携带miR-30a的慢病毒表达载体，为研究miR-30a在慢性粒细胞白血病中的作用机制及对伊马替尼耐药性的影响奠定基础。方法提取人骨髓细胞基因组DNA，扩增miR-30a的前体序列，克隆到plVTHM慢病毒表达载体上，测序鉴定。重组载体进行病毒包装，感染K562细胞，测定病毒滴度。感染的K562细胞用流式细胞仪分选带有绿色荧光的GFP阳性的细胞，对分选的细胞用实时荧光定量PCR法检测miR-30a在细胞内的表达水平。最后用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况。结果重组慢病毒表达载体测序完全正确；病毒滴度检测为6×106TU/mL；选用160 μL病毒液/1 mL培养基感染K562细胞；感染的K562细胞中miR-30a的表达水平显著增强(Plt;0.05)；过表达miR-30a后K562细胞增殖水平显著下降(Plt;0.05)。结论成功构建了miR-30a慢病毒表达载体，并可在K562细胞中稳定表达，且miR-30a有抑制K562细胞增殖的作用。

miR-30a；慢病毒表达载体；载体构建

miRNA是一类长21～25 nt的小分子非编码单链RNA的总称，不编码任何蛋白质，能够通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对，引起靶mRNA降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控，在生物的各项生理活动和生长发育过程中发挥着重要作用[1]。miR-30a位于人6号染色体长臂(6q13)，和肿瘤的发生[2]、转移[3]、侵袭[4]和治疗[5]等有密切关系。miR-30a的表达改变与肺癌[6]、肝癌[7]、肾小球内足细胞起源的肾脏疾病[8]、乳腺癌和神经胶质瘤[9]等的发生关系密切，与结肠癌、膀胱癌、乳腺癌[10]和肺癌[11]等肿瘤的侵袭性密切相关，miR-30a还可调节伊马替尼对慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)的治疗效果[12]，目前还未明确miR-30a是否通过调控多个靶基因，进而从多方面调节伊马替尼的治疗效果，本研究通过构建miR-30a过表达载体，并在细胞内进行验证，为研究伊马替尼耐药性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

(1)骨髓、细胞、菌株：人骨髓样本(南方医科大学附属南方医院提供)，与受试者签署知情同意书并获得南方医院伦理委员会批准书；293T细胞(南方医科大学肿瘤研究所提供)；K562细胞(广东省人民医院中心实验室提供)；质粒plVTHM、psPAX2、pMD2.G(南方医科大学公共卫生与热带医学学院张宝副教授惠赠)；大肠埃希菌DH5α(Escherichiacoli,E.coli)由本室保存。

(2)酶和主要试剂：限制性内切酶和T4 DNA连接酶(New England Biolabs公司)；EX Taq DNA聚合酶和SYBRPremixExTaqⅡ(大连宝生物工程公司)；Ficoll淋巴细胞分离液(GE公司)；QIAamp®DNA Mini and Blood Mini Kit和QIAGEN Plasmid Midi Kit(Qiagen公司)；Wizard®SV琼脂糖凝胶和PCR产物纯化系统(Promega公司)；转染试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；胎牛血清(Gibco公司)；Hairpin-itTMmicroRNA qPCR Quantitation Kit (上海吉玛公司)；引物合成及测序由Invitrogen(广州)公司完成; Cell Counting Kit(CCK-8)(DOJINDO公司)。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA 的提取:采用Ficoll法分离正常人骨髓细胞，采用QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Kit提取基因组DNA。

1.2.3 慢病毒颗粒的包装:在10 cm培养皿中接种293T细胞，培养24 h后细胞达到50%汇合，采用Lipofectamine 2000，共转染20 μg plVTHM-miR-30a、15 μg psPAX2、6 μg pMD2.G到293T细胞。转染48 h 后，4 ℃，1 000×g离心10 min，取病毒上清，将上清用0.45 μm滤器进行过滤，分装至1.5 mL EP管，-80 ℃保存。

1.2.4 病毒滴度测定:把K562细胞接种到96 孔板中，培养24 h后进行感染。设5个病毒浓度梯度组，每组加入不同量病毒液，分别为40、80、160、320和640 μL，设2个对照组，1组加polybrene，终浓度5 mg/L，1组为阴性对照。培养72 h后，用倒置显微镜观察并纪录每个稀释梯度中具有绿色荧光的细胞个数。根据病毒上清液体积、稀释的倍数、GFP荧光的细胞数，计算出病毒上清液的滴度：滴度={(%GFP阳性细胞数〕×(第2天细胞数/mL)}/病毒量(mL)。每组设3个复孔，结果取平均值。

1.2.5 感染:在6孔板中接种K562细胞，每孔加入320 μL病毒液，加入培养基至2 mL。24 h后，移去病毒上清稀释液，继续培养72 h后，用流式细胞仪进行分选。

1.2.6 分选GFP阳性细胞:收集感染后的细胞，用流式细胞仪分选带有绿色荧光的GFP阳性细胞，扩大培养。

1.2.7 荧光定量PCR检测miR-30a的表达:采用Hairpin-itTMmicroRNA qPCR Quantitation Kit检测miR-30a的表达，P3为Q-miR-30a上、下游引物混合物：5′-CACTCTCATGTAAACATCCTCGACTATGGTTG TTCTGCTCTCTGTGTC-3′，P4为Q-U6(内参)上、下游引物混合物:5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，PCR反应条件为95 ℃，3 min；95 ℃，12 s，62 ℃，40 s，共40循环。

1.2.8 细胞增殖检测:采用CCK-8法检测细胞的增殖水平，分别接种K562细胞、plv空病毒细胞、过表达miR-30a细胞到96孔板中，每孔加入CCK-8溶液10 μL，培养4 h后，在450 nm测定吸光度。每个样品设3个复孔，实验重复3次。

2 结果

2.1慢病毒表达载体plVTHM-miR-30a的构建及鉴定

M.DL2000 Marker(Takara); 1.pre-miR-30a图1 Pre-miR-30a的扩增序列Fig 1 Pre-miR-30a amplification products

PCR产物大小预计为271 bp(图1)，与预期一致。酶切鉴定正确(图2)，送测序。选择测序正确的重组质粒进行下一步实验，操作结果如下：

M.DL2000 Marker(Takara); 1.plVTHM-miR-30a图2 plVTHM-miR-30a酶切结果Fig 2 plVTHM-miR-30a digestion results

2.2 包装病毒，滴度测定，分选GFP阳性细胞

由plVTHM-miR-30a包装的病毒命名为30a病毒，由plVTHM包装的病毒命名为plv病毒。病毒滴度检测为6×106TU/mL。不同浓度病毒液感染K562细胞的感染效率不同(图3)，最后选择用160 μL病毒液/1 mL培养基感染细胞。流式细胞仪分选后的细胞扩大培养，30a病毒感染的细胞命名为过表达miR-30a细胞，plv病毒感染的细胞命名为plv空病毒细胞。

2.3 荧光定量PCR检测miR-30a表达水平

plv空病毒细胞和K562细胞中miR-30a的表达很低且基本一致，miR-30a细胞中miR-30a的表达明显高于其他两组(Plt;0.05)(图4)。

2.4 细胞增殖检测

K562细胞增殖gt;plv空病毒细胞gt;过表达miR-30a细胞(表1、图5), 过表达miR-30a细胞的增殖显著慢于K562细胞和plv细胞(Plt;0.05)。

3 讨论

miRNA功能研究的基础是构建成能够在细胞内稳定表达miRNA的载体，根据导入miRNA结构的不同分为以下4种形式：pri-miRNA(primary-microRNA)、pre-miRNA(precursor-miRNA)、mat-miRNA(mature-miRNA)和amiRNA(artificial-miRNA)。Pri-miRNA是miRNA存在的最原始形式，长度大约为300～1 000个碱基，通常取大约400 bp左右的序列，构建到含有CMV等启动子的载体上，一般认为只有成熟的miRNA才能在体内发挥作用，故很少采用该形式构建miRNA真核表达载体。以pre-miRNA形式构建miRNA的表达载体是应用最广泛的构建形式，pre-miRNA大约70 bp，通常上下游各扩展100 bp，然后构建到含有H1或U6启动子的载体上进行表达，载体选择性相对较窄。Mat-miRNA是一类长度约为22 bp的小分子非编码单链RNA，mat-miRNA诱导基因表达的效率不如其前体高，因此很少采用。AmiRNA技术可以迅速分析单个基因或多个同源基因以及多个非同源基因的功能，以天然miRNA前体作为amiRNA前体的骨架，可以产生预期amiRNA抑制特定靶基因的效果，逐渐受到研究者的关注。本研究采用pre-miRNA形式构建载体，成功构建了miR-30a慢病毒表达载体，并进一步构建了稳定表达miR-30a的细胞。

图3 不同浓度病毒感染K562结果Fig 3 Different concentrations of virus infection of K562(×10)

*Plt;0.05 compared with cells overexpressed miR-30a图4 不同细胞中miR-30a的表达水平Fig 4 miR-30a expression levels in different cells

表1 CCK-8法检测不同细胞增殖的结果Table 1 The detection of different cells proliferation

*Plt;0.05 compared with K562；#Plt;0.05 compared with plv.

*Plt;0.05 compared with K562 cells;#Plt;0.05 compared with plv cells图5 CCK-8法检测不同细胞的增殖结果Fig 5 The detection of different cells proliferation by CCK-8

本研究进一步检测了不同细胞的增殖情况，结果表明过表达miR-30a细胞和K562细胞相比，增殖水平显著下降，提示miR-30a可以抑制K562细胞的增殖。miR-30a在其他肿瘤细胞中也有类似抑制肿瘤细胞增殖的情况出现，如肝癌[13]、乳腺癌[14]、神经胶质瘤[15]等。在慢粒细胞中miR-30a抑制细胞的增殖，是否和伊马替尼治疗慢粒的耐药机制有关，仍需进一步研究。

总之，本试验为研究miR-30a在慢粒中的表达调控及伊马替尼的耐药机制提供了依据。

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Construction, packaging and expression activity of miR-30a expression vector

LIU Yue1, SHUAI Chun2, YIN Hong1, SONG Yan-bin1*, MA Wen-li1*

(1.Institute of Genetic Engineering, Southern Medical University, Guangzhou 510515;2.Dept. of Neonatology, Yuexiu Branch of Guangdong Maternal and Child Health Hospital, Guangzhou 510000，China)

ObjectiveTo construct a lentiviral miR-30a expression vector for the study of the mechanism of miR-30a in chronic myeloid leukemia and the impact to imatinib resistance.MethodsHuman bone marrow genomic DNA was extracted, miR-30a precursor sequence was amplificated and cloned into the lentivirus expression vector plVTHM, then sended sequencing. The recombinant vector was packaged in 293T cells and tittered in K562 cells. GFP-positive K562 cells with green fluorescence were sorted by flow cytometry, miR-30a expression level in sorted cells was further detected by RT-PCR. The proliferation of different cells was detected by CCK-8 assay.ResultsSequencing of the recombinant lentiviral expression vector was completely correct; viral titer was 6×106TU/mL; 160 μL virus solution / 1mL medium was selected to infect K562 cells; the expression level of miR-30a in infected K562 cells was significantly enhanced(Plt;0.05); the proliferation levels of cells overexpressed miR-30a decreased significantly (Plt;0.05).ConclusionsmiR-30a lentivirus vector is succ-essfully constructed and miR-30a is stably expressed in K562 cells, and miR-30a may inhibit the proliferation level of K562 cells.

miR-30a; lentiviral vector; vector construction

2013-11-28

2014-01-15

广东省医学科研基金(B2013220)，南方医科大学2012年度“科研启动计划”青年科技人员培育项目;广东省科技计划项目(2012B031800135);广东省自然科学基金(S2011020003140)

*通信作者(correspondingauthor)： vliuyuemoon@163.com, sunshine@fimmu.com

1001-6325(2014)04-0494-05

研究论文

Q784

A