MEF来源的间充质干细胞诱导生成的调节型树突状细胞的基因表达谱分析

葛超卓，刘星霞，任少达，赵春华

(中国医学科学院 基础医学研究所 组织工程中心， 北京 100005)

主编点评：

树突状细胞(dendritic cell, DC)是高度异质性的细胞群体，根据DC的功能特点，具有很强调节功能的DC亚群被命名为调节性DC(regulatory DC)。葛超卓等人研究MEF-MSC诱导HPCs生成的调节性DC与不成熟DC(imDC)和成熟DC(maDC)的基因表达谱，揭示了三者在功能相关基因、免疫相关基因和信号通路相关基因方面的显著差异，进一步丰富了界定DC亚群的依据。

研究论文

MEF来源的间充质干细胞诱导生成的调节型树突状细胞的基因表达谱分析

葛超卓，刘星霞，任少达，赵春华*

(中国医学科学院 基础医学研究所 组织工程中心， 北京 100005)

目的研究MEF来源的间充质干细胞(MEF-MSC)诱导的调节型树突状细胞(MEF-regDC)与不成熟树突状细胞(imDC)和成熟树突状细胞(maDC)之间的基因表达谱差异，从而揭示前者的基因表达特点。方法将骨髓造血干细胞与MEF-MSC共培养制备MEF-regDC，用Agilent芯片对3种树突状细胞(DC)进行基因芯片检测及相关分析，分析项目包括：差异倍数计算、主成分分析(PCA)和Go分类。结果MEF-regDC具有特征性的形态、表型和基因表达谱，PCA分析表明，MEF-regDC、imDC和maDC是不同的DC亚群，MEF-regDC与imDC相比，表达差异在2倍以上的基因数共有13 369个，差异在6倍以上的有3 247个，MEF-regDC与maDC相比，表达差异在2倍以上的基因数共有11 326个，差异在5倍以上的有3 299个，进一步的分析显示，3者在功能调节相关基因，免疫相关的基因和信号通路相关的基因的表达也有显著差异。结论MEF-MSCs诱导HPCs生成的MEF-regDC是一不同于传统imDC及maDC的具有特征性基因表达谱的DC亚群。

树突状细胞；间充质干细胞；基因差异；基因芯片分析

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)作为一类重要的干细胞，它不仅具有自我更新和多向分化潜能，而且更为重要的是具有较低的免疫原性及较强的免疫调节性[1-3]。研究表明，MSCs能够分泌抑制性细胞因子，抑制T淋巴细胞的活化、增殖，以及树突细胞(dendritic cells，DCs)的成熟和功能[4-8]。MSCs能够在体内外作用于T、B淋巴细胞而发挥免疫调节作用[9]，但是关于MSCs和重要的抗原递呈细胞之一的树突细胞的相互关系的研究不多，且MSCs对树突细胞的免疫调控作用机制尚不明确。有研究表明，MSCs无论对造血干细胞还是成熟树突状细胞(mature dendritic cells，maDCs)都具有很重要的免疫调节作用，MSCs不仅能够影响maDC的分化[10]，还能够影响造血干细胞向DC(immature DC，imDC)的发育[11]。在此基础上，本实验着重研究MSCs诱生的regDC的基因表达谱特点。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

基因芯片：mouse 4x44K microarrays(Agilent 公司)，其余分析所用试剂如下：

reagentcompanymodelnumbercy3NHSesterGEhealthcarePA13105aaUTPAmbionAM8436lowRNAinputlinearamplicationkitAgilent5184-3523geneexpressionhybridizationkitAgilent5188-5242geneexpressionwashbufferkit(includingwashbuffer1amp;2)Agilent5188-5327stabilizationanddryingsolutionAgilent5185-5979gasketslideAgilentG2534-60003hybridizationchamberAgilentG2534ARNeasyminikitQIAGEN74106

1.2 MEF-MSC的制备

常规法制备MEF-MSC[11]，用MSC培养液重悬细胞，接种在75 cm2的培养瓶中， 37 ℃，5% CO2的培养箱中孵育培养。

1.3 imDC和maDC的制备

常规法制备骨髓单个核细胞[11]，用含10 ng/mL mGM-CSF、5 ng/mL mIL-4和10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，细胞以1×106/孔加入6孔板中，置37 ℃和5% CO2孵箱培养；24 h后，去悬浮细胞，重新加入含粒细胞-巨噬细胞集落刺激(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)新鲜培养基，继续培养；3 d后，轻轻去除悬浮细胞，收集疏松贴壁细胞，用免疫磁珠纯化CD11c+细胞，获得富集的imDCs；纯化的imDCs继续在含10 ng/mL LPS的培养基中孵育24～48 h，即获得maDCs。

1.4 MEF-regDC的制备

将纯化的骨髓造血干细胞与MEF-MSC共培养5～7 d，获得MEF-regDCs[11]。

1.5 基因芯片的制备

基因芯片的制备方法，简述如下：1)总RNA的纯化(QIAGEN RNeasy® Mini Kit)。2)cDNA第一链和第二链一步法合成。3)aaUTP标记cRNA合成。4)cRNA纯化(QIAGEN RNeasy® Mini Kit)。5)cRNA浓度测定。6)cRNA样品荧光标记。7)荧光标记cRNA样品纯化(QIAGEN RNeasy® Mini Kit)，QIAGEN RNeasy Mini kit纯化cRNA，具体方法可参见QIAGEN公司随试剂盒提供的操作手册。8) 荧光分子浓度及掺入率计算，Cy3-浓度(μmol/L)=A552/0.15；Cy3-掺入率(μmol/g)= Cy3-浓度/cRNA浓度(g/L)。9)cRNA样品片段化和芯片杂交(4×44K microarrays)。10)芯片洗涤，取出芯片于洗液1中洗涤1 min，再将芯片放入洗液2中洗涤1 min(37 ℃)。11)芯片扫描，Agilent扫描仪中扫描，分辨率为5 μm，扫描仪自动以100%和10%光电倍增管(PMT)各扫描一次，两次结果Agilent软件可自动合并。12)数据由上海伯豪公司的在线数据分析系统SAS(SBC Analysis System)分析。分析项目包括：差异倍数计算(Fold change)、主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)和Go分类(GoTerm to Gene)。①差异倍数计算：是直接对两组数据均一化以后的信号值计算其差异的倍数。②主成分分析：其原理是找到数据方差最大的2个或者3个主成分(就是向量)，将数据投影在这些主成分上，已达到降维的目的，分析结果以二维图像显示，通过图像上的点之间的相互距离来显示样品之间的相似度。③Go分类：每个GoTerm对应基因的情况以及探针对应基因在Go数据库中分组显示。

2 结果

2.1 MEF-MSC的形态

细胞生长呈现为梭形或纺锤形，类似成纤维样形态(图1)。

图1 MEF-MSC细胞形态Fig 1 The morphology of MEF-MSC(×100)

2.2 MEF-MSC诱导生成的regDC的形态

镜下观察可见，MEF-regDC的形态和imDC相似，但与maDC相比，MEF-regDC的树突较少且短(图2)。

2.3 基因表达谱分析

2.3.1 主成分分析：PCA分析结果表明，MEF-regDC是与imDC和maDC不同的亚群(图3)。

2.3.2 差异倍数计算：芯片结果显示，MEF-regDC的基因表达谱与imDC和maDC的不同，3者之间存在表达差异的基因数量也有差别(表1)。

表1 MEF-regDC与imDC、maDC间的差异基因数量Table 1 The number of different genes between MEF-regDC and imDC amp; maDC

A.MEF-regDC; B.imDC; C.maDC图2 MEF-regDC、imDC和maDC的形态Fig 2 The morphology of MEF-regDC, imDC and maDC(×200)

图3 MEF-regDC, imDC与maDC的PCA分析Fig 3 PCA of MEF-regDC, imDC and maDC

2.3.3 基因表达谱分类分析：在存在差异的基因当中，应用Go分类进一步分析分别得到MEF-regDC与imDC间关于功能调节的差异基因数量(图4)，与免疫相关的差异基因数量(图6)以及MEF-regDC与imDC间信号通路相关的差异基因数量(图8)。同样，对MEF-regDC和maDC也进行了相似的分析(图5，7，9)。

1)功能调节相关基因的表达差异：

2)与免疫相关的基因的表达差异：

3)信号通路相关的基因的表达差异：

图4 MEF-regDC与imDC间关于功能调节的差异基因数量Fig 4 The number of different genes related to function regulation between MEF-regDC and imDC

图5 MEF-regDC与maDC间关于功能调节的差异基因数量Fig 5 The number of different genes related to function regulation between MEF-regDC and maDC

图6 MEF-regDC与imDC间与免疫相关的差异基因数量Fig 6 The number of different genes related to immune function between MEF-regDC and imDC

图7 MEF-regDC与maDC间与免疫相关的差异基因数量Fig 7 The number of different genes related to immune function between MEF-regDC and maDC

图8 MEF-regDC与imDC间与信号通路相关的差异基因数量Fig 8 The number of different genes related to signal passways between MEF-regDC and imDC

图9 MEF-regDC与imDC间与信号通路相关的差异基因数量Fig 9 The number of different genes related to signal passways between MEF-regDC and maDC

3 讨论

作为一类重要的干细胞，MSC不仅具有自我更新和多向分化潜能，而且具有及较强的免疫调节作用和较低的免疫原性，因而，在器官移植或者自身免疫性疾病的治疗中发挥重要作用。MEF来源的MSC可以诱导骨髓造血干细胞生成具有免疫调节作用的树突状细胞(MEF-regDC)[11]，进一步的分析显示，MEF-regDC具有特征性的形态、表型和基因表达特点。

对3种DC细胞进行主成分分析(principal component analysis，PCA)，结果较直观地反映了3者间的差异程度。MEF-regDCs与imDC的差异程度较MEF-regDCs和maDC间的差异小。

应用Go分类分析可知，MEF-regDC与imDC的差异基因中，1 773个基因与分子结构相关，1 868个基因与细胞组分相关，1 680个基因参与了生物学功能(其中760个基因参与了功能调控)。在生物学功能相关差异基因中挑选与免疫相关的基因进行深入分析，免疫系统调控相关基因69个，占目前已知总数的23.08%(69/299)，差异较大。此外，两细胞群体间的信号通路也存在一定的差异。由上可见，MEF-regDCs与imDCs在免疫学功能基因表达等多方面存在差异。

同样，应用Go分类分析可知，MEF-regDC与maDC的差异基因中，1 777个基因与分子结构相关，1 845个基因与细胞组分相关，1 663个基因参与了生物学功能(其中783个基因参与了功能调控)。与免疫相关的差异基因中，免疫系统调控相关基因81个，占目前已知总数的27.09%(81/299)，各项差异值均高于MEF-regDC与imDC间的差异。而且，两细胞群体间的信号通路差异也较大。由上可见，MEF-regDCs与maDCs存在较大的差异。

总之，MEF-MSCs诱导HPCs生成的MEF-regDCs是一不同于传统imDC及maDC的具有特征性基因表达谱的DC亚群。

[1] Aldinucci A, Rizzetto L, Pieri L,etal. Inhibition of immune synapse by altered dendritic cell actin distribution: a new pathway of mesenchymal stem cell immune regulation [J]. J Immunol, 2010, 185:5102-5110.

[2] Uccelli A, Moretta L, Pistoia V. Mesenchymal stem cells in health and disease [J]. Nat Rev Immunol, 2008, 8:726-736.

[3] Maggini J, Mirkin G, Bognanni I,etal. Mouse bone marrow-derived mesenchymal stromal cells turn activated macrophages into a regulatory-like profile [J]. PLoS One, 2010, 5:9252.

[4] Lewis KL, Caton ML, Bogunovic M,etal. Notch2 receptor signaling controls functional differentiation of dendritic cells in the spleen and intestine [J]. Immunity, 2011, 35:780-791.

[5] Jankovic D, Kugler DG, Sher A. IL-10 production by CD4+effector T cells: a mechanism for self-regulation [J]. Mucosal Immunol, 2010, 3:239-246.

[6] Zhao RC, Liao L, Han Q. Mechanisms of and perspectives on the mesenchymal stem cell in immunotherapy [J]. J Lab Clin Med, 2004, 143:284-291.

[7] Ren G, Zhang L, Zhao X,etal. Mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression occurs via concerted action of chemokines and nitric oxide [J]. Cell Stem Cell, 2008, 2:141-150.

[8] Wada N, Gronthos S, Bartold PM. Immunomodulatory effects of stem cells [J]. Periodontology, 2000, 2013, 63:198-216.

[9] Xu X, Yi H, Guo Z,etal. Splenic stroma-educated regulatory dendritic cells induce apoptosis of activated CD4 T cells via Fas ligand-enhanced IFN-gamma and nitric oxide [J]. J Immunol, 2011, 188:1168-1177.

[10] Zhang B, Liu R, Shi D,etal. Mesenchymal stem cells induce mature dendritic cells into a novel Jagged-2-dependent regulatory dendritic cell population [J]. Blood, 2009, 113:46-57.

[11] Liu X, Qu X, Chen Y,etal. Mesenchymal stem/stromal cells induce the generation of novel IL-10-dependent regulatory dendritic cells by SOCS3 activation [J]. J Immunol, 2012, 189:1182-1192.

The gene expression profile analysis of regDC induced by MEF-MSC

GE Chao-zhuo, LIU Xing-xia, REN Shao-da, ZHAO Chun-hua*

(Center of Tissue Engineering, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS, Beijing 100005, China)

ObjectiveTo investigate the difference of gene expression between MEF-regDC and imDC amp; maDC, in order to demonstrate the character of MEF-regDC.MethodsWe first harvested MEF-regDC by co-culture of bone marrow hematopoietic stem cell with MSC, then analysed 3 types of DCs, including fold change, principal component analysis and Go Term to gene.ResultsMEF-regDC had the characteristic of morphology, phenotypes and gene expression profile, the PCA illustrated that MEF-regDC and imDC amp; maDC were 3 different type of DC, and there were 13 369 genes that were 2 folds different between MEF-regDC and imDC, and the number of genes that were 6 fold different between the 2 types of DCs is 3247; meanwhile, the number of different genes between MEF-regDC and maDC are 11326 and 3299, respectively. Further analysis demonstrated that, there were obvious difference of function regulate genes, immune-related genes and signaling pathways related genes among these three type of DCs.ConclusionsMEF-regDC is a new type of DC which is different from imDC and maDC, and has specific gene expression profiles.

dendritic cells; mesenchymal stem cells; gene differentiation; gene analysis

2013-12-20

2014-01-11

国家自然科学基金(30911130363)

*通信作者(correspondingauthor)： zhaoch16@hotmail.com

1001-6325(2014)04-0433-06

R 329.2

A