烟草内生细菌种群特征分析

陈泽斌, 夏振远, 雷丽萍, 徐胜光, 王墨浪, 寸林江, 李啟

1昆明学院农学院,云南省都市型休闲农业工程技术研究中心,昆明,650214;

2云南省烟草农业科学研究院,昆明,650031;

3云南省烟草公司保山市公司,保山,678000

烟草内生细菌种群特征分析

陈泽斌1, 夏振远2, 雷丽萍2, 徐胜光1, 王墨浪3, 寸林江1, 李啟1

1昆明学院农学院,云南省都市型休闲农业工程技术研究中心,昆明,650214;

2云南省烟草农业科学研究院,昆明,650031;

3云南省烟草公司保山市公司,保山,678000

为探明烟草内生细菌种群特征及其与烟草的关系,采用研磨组织稀释分离法分离不同品种、不同生长期、不同器官的烟草内生细菌,以各菌群出现与否为指标,用类平均法进行系统聚类分析,对内生细菌的种类组成,分布特征进行了研究。结果表明,烟草内生细菌种类组成存在品种差异、生长期差异和组织部位差异；优势菌群随分离部位和生长时期的不同而变化。Bacillussp.和Rhizobiumsp.是4个品种烟草叶片共有的优势类群,从苗期到团棵期,内生细菌的种类在增加,B.pumilus广泛存在于成熟期烟草的根、茎、叶中,且为主要菌群。部分内生细菌具有组织偏好性,Micrococcussp.和Staphylococcussp.对烟草的茎部具有偏好性,B.cereus对烟草叶片具有偏好性。研究结果为烟草有益内生细菌的筛选奠定了基础,并为内生细菌在其它植物中的开发利用提供理论依据。

烟草; 内生细菌; 种群; 特征分析

植物内生细菌在与植物的长期进化过程中,与宿主相互选择,相互影响,形成了一种复杂、特殊的关系,包括互惠共生关系以及无害的或有害的寄生关系,且两种关系可以在一定的条件下相互转化。内生细菌的遗传多样性是由外部环境和宿主基因型等多种因素共同决定的[1]。植物内生细菌是植物体内的正常菌群,在宿主和环境的共同影响下形成了内生细菌的不同种群[2]。因此内生细菌在植株内的种类和数量不是一成不变,而是各有特点。不同品种宿主、不同生长季节、不同部位,其内生细菌的种群分布特征存在差异,这些差异在某种程度上也反映了宿主植物生长的外部环境状况。

近几年有关内生细菌的研究主要集中在种群密度调查、种群多样性分析、防病促生内生细菌的筛选与应用,已有大量的文献报道[3-5]。涉及的植物包括：番茄、花生、棉花、玉米、水稻等作物。而对我国重要经济作物烟草有关内生细菌的研究鲜见报道,唯有马冠华,肖崇光两位学者针对烟草不同品种、不同栽培时期及不同组织的内生细菌种群作了初步调查[6],为探明烟草内生细菌种群特征及其与烟草的关系,笔者选取了云南省种植的4个烟草品种为试验材料,对不同生长期根、茎、叶内生细菌种群特征展开研究。揭示烟草不同品种、不同生长期、不同组织中内生细菌的种类、多样性及分布,探讨了内生细菌对宿主品种和组织的偏好性。

1 材料与方法

1.1 样品的采集和处理

以云南省玉溪市世界烟草品种园中的云烟85,K326,红花大金元（以下简称红大）以及KRK26不同生长期的叶片,成熟期的根、茎为试验材料。选择生长性状良好的健康植株采样。样品采集后装于密封的采样袋中,低温保鲜,24 h之内进行内生细菌的分离。

1.2 培养基及主要试剂

内生细菌分离和培养用NA[7]、液体培养用LB[7],基因组DNA提取,16S rDNA片段扩增所用的各种酶、Marker、dNTPs,Buffer等试剂为宝生物工程（大连）产品；其余试剂均为国产分析纯。

1.3 内生细菌的分离

按文献[8]的方法。

1.4 菌落计数

选取合适的平板（每皿30～300个菌落）对菌落计数,并计算每克植株鲜重的菌落形成单位数（Colony-Forming Units Per Gram Fresh Weight）cfu/g.fw=（菌落数 × 稀释倍数 × 分离用水量）／（涂板用水量 × 分离组织重量）。

1.5 内生细菌的鉴定

按文献[8]的方法。

1.6 内生细菌群落多样性分析

将内生细菌的种类作为数量测度,用DPS软件分析烟草内生细菌的香农多样性指数Shannon -Wiener（H）[9]、均匀度指数 Evenness（E）[9]。

1.7 内生细菌在烟草植株内的分布特征

以各菌群是否分离到为指标,组成“0-1”数据矩阵,将所得数据输入DPS数据处理系统,采用Watson距离为聚类尺度,以类平均法对数据进行系统聚类分析,得出各菌群的分布特征聚类图。

2 结果与分析

2.1 不同烟草品种叶片内生细菌种群特征分析

云烟85、KRK26、K326、红大叶片内生细菌的种类与所占比例见图1（分离时期为苗期、团棵期、旺长期、成熟期）,云烟85中含量最高的三种类群为Pantoea agglomerans、Rhizobiumsp.、Bacillus pumilus,所占比例分别为20.40%、21.71%、19.20%。KRK26中含量最高的三种类群为B.pumilus、Rhizobiumsp.、B.cereus,所占比例分别为23.89%、33.81%、15.60%。红大中含量最高的 三 种 类 群 为B.pumilus、Rhizobiumsp.、Pantoea agglomerans,所占比例分别为23.04%、27.41%、10.06%。K326中含量最高的三种类群为Pantoea agglomerans、B.cereus、Rhizobiumsp., 所 占 比例分别为29.09%、25.71%、12.90%。由此可见,Bacillussp.和Rhizobiumsp.是4个品种烟草叶片共有的优势类群,在4个品种烟草叶片中均有分布,含量在12.90%-33.81%间。可以推断Bacillussp.和Rhizobiumsp.类群细菌广泛存在于4个品种烟草叶片中,说明其对烟草组织的侵染力很强且具有广谱性,能够进入4个品种的植株中,其他优势类群的分布则因烟草品种而异。

以各菌群在各品种叶片中出现与否为指标,用类平均法对数据进行系统聚类分析,结果见图2,当Watson聚类距离λ=0时,分为8个类群。类群1 包括B.pumilus、B.amyloliquefaciens、B.subtilis、B.megaterium、B.flexus、B.simplex、B.cereus、Micrococcussp.、Rhizobiumsp.、Sphingomonassp.、Pantoea agglomerans、Acinetobactersp.、Stenotrophomonassp.,它们普遍存在于4个品种烟草叶片中。类群2包括Microbacteriumsp.、Alcaligenes faecalis,少量（≤3.00%）存在于云烟85、KRK26、K326这三个品种叶片中。类群3仅有B.licheniformis,少量（≤0.06%）存在于KRK26和K326叶片中。类群4包括Staphylococcussp.,少量（≤0.26%）存在于云烟85和KRK26叶片中。类群5仅有Pseudomonassp.,少量（≤0.27%）存在于红大和K326叶片中。类群6仅有Sporosarcinasp.,少量（0.37%）存在于KRK26叶片中。类群7仅有Bifissio spartinae,少量（≤0.33%）存在于KRK26和红大叶片中,类群8仅有Naxibactersp.,少量（0.39%）存在于云烟85叶片中。由于类群2-8包括的种群均是少量存在于某个或某几个烟草品种叶片中,数目极少,是稀有的种群,不能判断它们是否具有品种专化性。

分析了不同品种烟草叶片内生细菌的香农多样性指数Shannon-Wiener（H）、均匀度指数Evenness（E）（表1）。香农多样性指数由大到小依次为云烟85＞ 红大 ＞ K326 ＞ KRK26,说明云烟85叶片中内生细菌的多样性最高。均匀度指数由大到小依次为红大＞ 云烟85 ＞ K326 ＞ KRK26,说明红大叶片中各内生细菌菌群分布最均匀,KRK26中优势种最突出。

图1 不同烟草品种叶内生细菌种类组成分析Fig.1 Analysis of endophytic bacteria flora in leaf of different tobacco cultivars

图2 不同烟草品种叶片内生细菌菌群聚类分析Fig.2 Cluster analysis of endophytic bacteria flora in leaf of different tobacco cultivars

表1 不同品种烟草叶片内生细菌多样性指数Tab.1 Diversity index of endophytic bacteria in leaf of different tobacco cultivars

2.2 不同生长期叶内生细菌种群特征分析

苗期、团棵期、旺长期、成熟期4个生长时期烟草叶片内生细菌种类与所占比例见图3（分离品种包括云烟85、KRK26、K326、红大）,苗期叶片中含量最高的三种类群为B.pumilus、B.cereus、B.megaterium,所占比例分别为63.07%、11.48%、5.63%。团棵期中含量最高的三种类群为P.agglomerans、R.sp.、Acinetobactersp.,所占比例分别为21.84%、17.77%、17.00%。旺长期中含量最高的三种类群为P.agglomerans、B.cereus、B.megaterium, 所 占比例分别为33.45%、28.52%、11.25%。成熟期中含量最高的三种类群为Rhizobiumsp.、B.pumilus、B.cereus.,所占比例分别为32.49%、19.03%、16.59%。从苗期到团棵期,内生细菌的种类在增加,团棵期除了未分离到苗期中少量存在的B.licheniformis和Bifissio spartinae外,相比苗期增加了Sporosarcinasp.、Sphingomonassp.、Alcaligenes faecalis、Pseudomonassp.、Stenotrophomonassp.5 个类群的细菌,到旺长期又降至11种,成熟期又新增了Microbacteriumsp.、Micrococcussp.两种细菌。这表明不同生长期叶片内生细菌种类存在差异,这可能与不同烟草生长期中的温度、湿度关系密切。

不同生长期叶片内生细菌各菌群系统聚类分析结果见图4,当Watson聚类距离λ=0时,分为8个类群。类群1包括B.pumilus、B.amyloliquefaciens、B.subtilis、B.megaterium、B.flexus、B.cereus、Rhizobiumsp.、P.agglomerans、Acinetobactersp.。它们的共同特征是存在于烟草叶片的各个生长期中,为常住菌群[6]（Resident Flora）。类群2仅有B.licheniformis,其特征是少量（≤0.28%）存在于苗期和旺长期叶片中。类群3仅有Microbacteriumsp.、Micrococcussp,它们的共同特征是少量（≤4.15%）存在于烟草成熟期叶片中。类群4包括Sphingomonassp.、Stenotrophomonassp., 少 量（≤5.39%）存在于苗期和成熟期叶片中。类群5包括B.simplex.、Naxibactersp.。它们的共同特征是少量（≤3.54%）存在烟草的苗期和团棵期叶片中。类 群 6 包 括Sporosarcinasp.、Alcaligenes faecalis、Pseudomonassp.,它们少量（≤0.77%）存在于烟草团棵期叶片中。类群7仅有Bifissio spartinae,少量（2.90%）存在于苗期烟草叶片中,类群8包括Staphylococcussp.,少量（0.35%）存在于烟草旺长期叶片中。类群2-8的细菌只在某一特定生长期或某几个生长期中存在,为暂居菌群（Transient Flora）。这可能与大多数内生细菌属于兼性内生细菌有关[10]。

对不同生长期烟草叶片内生细菌的多样性进行了分析（表2）。香农多样性指数由大到小依次为团棵期 ＞ 成熟期 ＞ 旺长期 ＞ 苗期,说明团棵期叶片中内生细菌的多样性最高。均匀度指数由大到小依次为团棵期 ＞ 旺长期 ＞ 成熟期 ＞ 苗期,说明团棵期中各内生细菌菌群分布最均匀,苗期优势种最突出。

图3 不同生长期烟草叶内生细菌种类组成分析Fig.3 Analysis of endophytic bacteria flora in leaf at different growing stages

图4 不同生长期烟草叶内生细菌菌群聚类分析Fig.4 Cluster analysis for endophytic bacteria flora in leaf at different growing stages of tobacco

表2 不同生长期烟草叶内生细菌多样性指数Tab.2 Diversity index of endophytic bacteria flora in leaf at different growing stages

2.3 成熟期根、茎、叶内生细菌种群特征分析

成熟期烟草根、茎、叶内生细菌种类与所占比例见图5（分离品种包括云烟85、KRK26、K326、红大。）,根部含量最高的三种类群为Rhizobiumsp.、B.megaterium、B.pumilus所占比例分别为45.46%、23.60%、21.90%。茎部含量最高的三种类群为B.pumilus、B.amyloliquefaciens、Staphylococcussp.,所占比例分别为26.56%、16.41%、13.09%。叶片中含量最高的三种类群为Rhizobiumsp.、B.pumilus、B.cereus,所占比例分别为32.49%、19.03%、16.59%。由此可见B.pumilus广泛分布于成熟期烟草根、茎、叶中,且为主要菌群。

成熟期不同器官各菌群系统聚类分析结果见图6,当Watson聚类距离λ=0时,分为6个类群。类 群 1包 括B.pumilus、B.amyloliquefaciens、B.subtilis、B.megaterium、Rhizobiumsp.、Acinetobactersp.,它们普遍存在于成熟期烟草的根、茎、叶中。类群 2包括B.flexus、Microbacteriumsp.、Micrococcussp.,只存在于茎和叶中。其中Micrococcussp.在茎中的含量达到11.33%,但在叶中的含量仅为0.89%。推测Micrococcussp.类群具有组织专化性,对烟草的茎部具有偏好性。类群3仅有B.simplex,少量（≤8.01%）存在于根和茎中,而叶中未分离到。类群4包括B.cereus、P.agglomerans、Stenotrophomonassp.只存在于成熟期根和叶中。其中B.cereus在叶中的含量为16.59%,而在根部的含量仅为0.12%。推测B.cereus类群具有组织专化性,对烟草叶片组织具有偏好性。类群5仅有Sphingomonassp.,少量（0.62%）存在于叶中。类群6包括Staphylococcussp.、Pseudomonassp.,它们只存在于茎中。其中Staphylococcussp.类群含量为13.09%,推测该属细菌具有组织专化性,对烟草茎部具有偏好性。

对成熟期根、茎、叶中内生细菌多样性进行了分析（表3）。香农多样性指数由大到小依次为茎 ＞叶 ＞ 根,说明茎中内生细菌的多样性最高。均匀度指数由大到小依次为茎 ＞ 叶 ＞ 根,说明茎中各内生细菌菌群分布最均匀,根中优势种最突出。

图5 成熟期烟草根、茎、叶内生细菌种类组成分析Fig.5 Analysis of endophytic bacteria flora in different organs at maturing stage

图6 成熟期烟草不同器官内生细菌菌群聚类分析Fig.6 Cluster analysis of endophytic bacteria flora in different organs at maturing stage of tobacco

表3 成熟期烟草不同器官内生细菌多样性指数Tab.3 Diversity index of endophytic bacteria flora in different organs at maturing stage

3 结论与讨论

对栽种在同一地区的4个品种烟草的内生细菌种群差异进行了分析,发现内生细菌在烟草植株中的定殖具有普遍性、多样性,某些内生细菌对烟草植株的侵染具有选择性。在分离到的所有烟草内生细菌中以Bacillus属细菌分布最广,已鉴定出8个种,包括B.pumilus,B.amyloliquefaciens,B.licheniformis,B.subtilis,B.megaterium,B.flexus,B.simplex,B.cereus。目前Bacillus属细菌已在番茄、花生、棉花、玉米、水稻等多种作物中作为优势类群多次被报道[3-5]。推测Bacillus属细菌可以与绝大多数植物共生,相比其它种类的内生细菌Bacillus属细菌更具有生存竞争力,且宿主专一性最小,成为多种植物内生细菌中的优势微生物。

不同品种烟草内生细菌的种群的组成、分布特点各不相同,其中Bacillussp.和Rhizobiumsp.类群细菌普遍存在于红大、K326、KRK26、云烟85四个生长期的叶片中,是4个品种烟草共有的优势类群,其他优势类群的分布则因烟草品种而异。这种差异可能与内生细菌对宿主的侵染具有选择性和特异性有关,某些内生细菌需要寻找到具有特定基因型及表型的宿主才能够成功侵染定殖。前人研究发现宿主植物的基因型能影响内生细菌的菌群组成[11]。不同品种宿主的基因型不同,引起宿主具有不同的表型和生理特征,导致内生细菌的生存环境条件不同,从而使得内生细菌菌群呈现出差异。还有的学者认为,有的内生细菌对宿主的基因型敏感,甚至在寄主种的水平上具有专一性[12]。鉴于此,可推断不同宿主的遗传背景能够在内生细菌的种群特征上得到体现[13-14],这一点需要在今后的研究中进一步验证和讨论。

随着宿主生长期的演替,其群落组成呈现动态差异,内生细菌的种类从苗期到成熟期一直在增加,这可能是由于生长时间的累积,不同内生细菌在烟草中的定殖率增加,其次,随着烟株的生长发育,烟株内部的生理特征与外部表型特征发生了改变,从而导致内生细菌种群特征和分布随之发生了改变。

Carroll等[12]研究了法国和瑞士针叶树上不同组织中的7种内生真菌群落,发现叶柄和叶顶端一些内生真菌种类明显不同,因此提出了一些内生真菌种类具有组织专一性的假说。本研究也发现某些烟草内生细菌具有组织专化性,例如Micrococcussp.和Staphylococcussp.只在烟草的茎部分离得到,B.cereus只在烟草叶片中分离得到,推测它们分别对烟草茎部、叶片具有偏好性,这与Carroll假说是一致的。这可能是由于不同的内生细菌对营养物质的需求不同,而不同器官组织的生理状态、化学物质组成和含有的营养物质不完全相同,从而造成了内生细菌侵染、定殖和分布的差异性[10]。

[1]Ahlholm J U, Helander M, Henriksson J, et al.Environmental conditions and host genotype direct genetic diversity of Venturia ditricha, a fungal endophyte of birch trees[J].Evolution Int J Org Evolution, 2002, 56(8): 1566-1573.

[2]Steven D S, Nathalie F, Anca M, et al.Selection of specific endophytic bacterial genotypes by plants in response to soil contamination[J].Appl Environ Microbiol, 2001, 67(6):2469-2475.

[3]Kiwamu M, Kiyo N, Taro M, et al.Anaerobic nitrogenfixing consortia consisting of clostridia isolated from gramineous plants[J].Appl Envir Microbiol, 2004, 70(5):3096-3102.

[4]Okon Y, ItzigsonhnR.The development ofAzospirillumas a commercial inoculants for improving crop yields[J].Biotechnol Adv, 1995, 13(3): 415-424.

[5]傅正擎, 夏正俊, 吴霭民, 等.内生菌对棉花黄萎病病菌及毒素的抑制作用和对棉花的促生作用[J].植物病理学报, 1999, 29(4): 374-375.

[6]马冠华, 肖崇光.烟草内生细菌种群动态研究[J].微生物学杂志, 2004, 24(4): 7-11.

[7]方中达.植病研究方法[M].北京: 中国农业出版社,1998: 47.

[8]陈泽斌, 夏振远, 雷丽萍, 等.烟草可培养内生细菌的分离及多样性分析[J].微生物学通报,2011, 38(9):1347-1354.

[9]戈峰.现代生态学[M].北京: 科学出版社, 2002: 252-254.

[10]Rodrigues K F.The foliar fungal endophytes of the Amazon palmEuterpe oleracea[J].Mycologia, 1994, 86:376-385.

[11]Pamela D, Adams P D, Kloepper J W.Effect of host genotype on indigenous bacterial endophytes of cotton(Gossypium hirsutumL.)[J].Plant and Soil, 2002,240: 181-189.

[12]Carroll F E, Muller E, Sutton B C.Preliminary studies on the incidence of needle endophytes on the some European confiers[J].Sydowia, 1997, 29:87-103.

[13]罗明, 卢云, 张祥林, 等.棉花内生细菌的分离及生防益菌的筛选[J].新疆农业科学, 2004, 41(5): 277-282.

[14]高增贵, 陈捷, 刘限, 等.玉米品种遗传多态性与根系内生细菌种群的相互关系[J].生态学报, 2006, 26(6): 1920-1925.

Characteristic analysis of endophytic bacteria population in tobacco

CHEN Zebin1,XIA Zhenyuan2,LEI Liping2,XU Shengguang1,WANG Molang3,CUN Linjiang1,LI Qi1
1 Agriculture College, Engineering Research Center for Urban Leisure Agriculture of Yunnan Province, Kunming University,Kunming 650214, China;
2 Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Kunming 650031, China;
3 Yunnan Baoshan Tobacco Company, Baoshan 678000, China

Endophytic bacteria were isolated from tobacco by the method of grinding separation.The composition of endophytic bacteria population in different cultivars, different tissues and different growth stages were studied.Results showed that the composition and quantity of dominant bacterial community varied with changes of cultivars, growth stages and tissues.Bacillussp.andRhizobiumsp.were considered as dominant genera of endophytic bacteria in leaf from different tobacco cultivars.The endophytic bacteria flora in leaf increased from seedling stage to maturing stage.B.pumiluswere considered as dominant genera of endophytic bacteria in root, stem and leaf during maturing stage.Cluster analysis in which euclidean distance was taken as similarity measure using group average method showed that endophytic bacteria in tobacco had tissue specificity.Micrococcussp.andStaphylococcussp.had tissue specificity to stem whileBacillus cereushad tissue specificity to leaf.The study could help to lay foundation for screening beneficial endophytic bacteria and to provide references for using in other crop plants.

tobacco; endophytic bacteria; population; characteristic analysis

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.03.017

TS414 文献标志码：A 文章编号：1004-5708（2014）03-0102-06

由云南省烟草公司科技项目（No.2012YN06）;云南省应用基础研究青年项目（No.2013FD040）;国家自然科学基金项目（No.41361056）;昆明学院大学生科研项目（No.DXS14070）

陈泽斌（1985—）,博士,讲师,研究方向：植物内生细菌多样性,Email：zbchenkmu@163.com

夏振远（1971—）,硕士,研究员,研究方向：烟草微生物的利用和控制,Tel：0871-65106032,Email：zyxia@yntsti.com

2013-06-07