红景天对肺癌多药耐药细胞A549／DDP的促凋亡作用研究

黎 萍，赵丽晶，张 捷，李君瑶，苟伟会，王 晶

（1.吉林大学第二医院 儿科，吉林 长春130041；2.吉林大学基础医学院病理生理学教研室，吉林 长春130021；3.吉林大学第二医院 呼吸内科，吉林 长春130041）

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤，也位居我国城市恶性肿瘤发病率及死亡率的首位，严重威胁人类 健 康[1]。非小细胞肺癌（non－small cell lung cancer，NSCLC）为肺癌的主要类型，占肺癌的75%－80%；由于目前肺癌的临床诊断水平尚比较有限，70%以上的NSCLC患者确诊时已为晚期，5年生存率低于10%。因此，化疗在NSCLC的治疗中具有重要作用；而NSCLC的化疗耐药极大的影响了肺癌的治疗效果[2]。近年来，寻找逆转化疗耐药的药物以及新的有效化疗药物已经成为肺癌研究的热点之一。

研究表明，多种天然植物中含有对人毒副作用小、并且十分有效的抗肿瘤成分；因而，国内外开发抗肿瘤药物的新方向之一即为植物类抗癌药物的研发。红景天（rhodiola sacra）有效成分是从红景天根中提取的，目前已分离出40多种，其主要有效成分为红景天甙。研究表明，红景天具有抗缺氧、抗氧化、抗寒冷、抗疲劳及抗肿瘤等作用[3]。近年来，关于红景天的抗肿瘤作用及其机制，国内外均可见报道，证实了红景天具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的作用[4，5]。但是红景天对肺癌多药耐药细胞是否有促凋亡作用，目前尚未见报道。为此，我们通过MTT法、流式细胞仪以及western blot法等实验方法来研究红景天对人肺腺癌多药耐药细胞A549／DDP的生长抑制、促凋亡作用，为进一步阐明红景天的抗肿瘤机制，用于肿瘤的临床治疗，尤其是在肺癌化疗耐药的临床应用，提供更多的实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料

人肺腺癌细胞多药耐药细胞系A549／DDP购自第三军医大学新桥医院呼吸病研究所。A549／DDP用RPMI－1640培养基（含10%新生牛血清），在37℃、5%CO2的孵箱内培养，胰酶消化、传代。红景天粉为北京同仁堂公司生产；MTT、顺铂购自美国Sigma公司；胰酶、RPMI－1640培养基为美国Hyclone公司产品；Annexin V－FITC细胞凋亡检测试剂盒、ECL发光试剂盒购自上海碧云天公司。cleaved caspase－3、cleaved PARP 一 抗 购 自 Cell Signal Techology公司，二抗购自武汉博士德公司。

1.2 MTT法检测细胞生存率

取对数生长期细胞，0.25%胰酶消化后，96孔板中每孔加入100μl细胞悬浮液，每孔含2×104个细胞。各组细胞加入0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、0mg／ml浓度梯度的红景天，每个浓度设4个复孔，至孵箱孵育24h后，各孔加入新鲜配制 MTT20μl（浓度为5g／L），温箱孵育4h，吸去上清，每孔加入100μl DMSO，震荡10min，用酶标仪检测各孔的吸光度值（OD570），计算细胞的生长抑制率：细胞生长抑制率（%）＝（1－实验组／对照组）×100%。

1.3 流式细胞术检测细胞的凋亡率

为了确定红景天是否具有诱导肺癌耐药细胞凋亡的作用，我们用1.8mg／ml红景天作用于A549／DDP细胞12、24、48h，分别收集细胞1×106个，加入500μl的缓冲液悬浮细胞；进行Annexin－V和Pl双染，混匀；于室温避光反应15min；在1h内入流式细胞仪检测、分析凋亡细胞比例。

1.4 凋亡相关蛋白的检测

采用1.8mg／ml红景天作用于A549／DDP细胞12、24、48h，收集细胞，提取各组细胞总蛋白，蛋白定量后，取30μg蛋白进行SDS－PAGE凝胶电泳，转膜，加入抗cleaved－caspase 3以及cleaved－PARP抗体杂交，再加入HRP－偶联二抗，按ECL试剂盒说明书发光、曝光。以β－actin为内参照，计算目的蛋白的相对光密度值。

1.5 统计学方法

本研究中所有计量数据以平均值±标准差表示，所有实验重复3次。3组以上资料间比较，采用多样本方差分析，组间两两比较采用LSD法；采用SPSS18.0软件进行数据的统计、分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 红景天抑制肺癌细胞增殖

用MTT法观察到A549／DDP细胞在红景天的作用下存活率均显著下降，并呈浓度依赖性和时间依赖性。计算出红景天对A549／DDP的24h IC50为 （1.91±0.32）mg／ml。

图1 不同浓度红景天对A549／DDP细胞生存率的影响

2.2 红景天作用下肺癌细胞形态学的改变

倒置相差显微镜观察结果：1.8mg／ml的红景天作用培养的A549／DDP细胞12h后，细胞团块变得松散，细胞皱缩呈圆形或卵圆形，折光性差，与邻近的细胞脱离，随着浓度的增高，越来越多的细胞脱离基质。随着浓度的增高，A549／DDP细胞细胞聚集成团的现象受到抑制，浓度越高，现象越明显，细胞相继皱缩，且折光性差越来越差。形态学结果提示，红景天可引起肺癌多药耐药细胞脱落凋亡或死亡，并呈时间依赖性和浓度依赖性。

2.3 红景天诱导A549／DDP细胞凋亡率的检测

为了确定红景天是否具有诱导肺癌耐药细胞凋亡的作用，我们用1.8mg／ml红景天作用于A549／DDP细胞12、24、48h，用 Annexin－V和Pl进行染色后，用流式细胞仪分析凋亡细胞，结果发现，红景天作用细胞后，早期凋亡的细胞和晚期凋亡的细胞均明显多于对照组，见表1；各组细胞蛋白电泳结果显示，凋亡相关蛋白cleaved－caspase 3以及cleaved PARP表达明显增加，且这种作用呈时间依赖，见图2。结果表明，药物作用组凋亡细胞所占的比例多于非药物作用组。上述结果提示，红景天时间依赖诱导A549／DDP肺癌多药耐药细胞发生凋亡。

表1 红景天作用下，A549／DDP细胞的凋亡率（±s；n＝3）单位：%

表1 红景天作用下，A549／DDP细胞的凋亡率（±s；n＝3）单位：%

注：＊与△比，P＜0.01；＊之间比较：P＜0.01.

作用时间 早期凋亡率 晚期凋亡率 总凋亡率空白对照组 0.51±0.12△ 2.19±0.43△ 2.7±0.54△12小时 2.32±0.37＊ 9.31±1.52＊ 11.63±2.12＊24小时 3.67±0.65＊ 18.56±3.27＊ 22.23±4.23＊48小时 6.22±1.02＊ 27.42±4.78＊ 33.64±5.12＊F 33.26 23.97 45.54 P＜0.000 ＜0.000 ＜0.000

图2 各组细胞凋亡相关蛋白电泳图

3 讨论

红景天系蔷薇目景天科红景天属，多年生草本或亚灌木野生植物，花、根、茎之浸液均呈红色而得名；药理学研究表明其主要药理活性成分为红景天苷（Salidroside）[3]。红景天对肿瘤的抑制作用国内外均有报道[4，5]。红景天在体外对人肝癌 HepG2细胞具有显著的抑制增殖和促进凋亡作用[6]；在体内可抑制肝癌荷瘤小鼠的肿瘤生长，延长其生存时间；具有明显的抗肿瘤作用，其机制可能与提高机体免疫功能有关[4]。红景天在体内、体外对乳腺癌、宫颈癌均有生长抑制作用[7]。本研究显示红景天可明显抑制人肺腺癌耐药细胞A549／DDP的生长，促进细胞凋亡。

肺癌是我国的肿瘤发病谱中的主要病种，对于其最常见的类型NSCLC，化疗药物的临床疗效已达到平台期，5年生存率仍较低。肿瘤细胞凋亡与肿瘤的发生、发展及治疗预后关系密切，耐药细胞对药物诱导的凋亡有耐受[8]。Caspase3是细胞凋亡的关键性蛋白酶，也是细胞凋亡的执行者，caspase3激活后，可自身裂解为cleaved caspase3并直接导致凋亡细胞解体，酶解细胞机构蛋白，其中最主要的蛋白为聚（ADP－核糖）（PARP）裂解为cleaved－PARP，最终导致细胞的凋亡。因而，casapase3以及PARP的裂解水平，即cleaved－caspase 3以及cleaved PARP的表达水平能反映凋亡的发生水平。已有报道表明，红景天可能通过干扰细胞代谢、改变细胞外衣的性质抑制肺腺癌细胞体外生长[9]。本研究中，红景天能抑制肺腺癌耐药细胞的生长，红景天对A549／DDP的抑制作用呈时间依赖性、浓度依赖性。通过计算，红景天对 A549／DDP抑制的24hIC50为（1.91±0.32）mg／ml；取略低于IC50的浓度1.8 mg／ml红景天作用于A549／DDP细胞，通过检测细胞凋亡率、凋亡相关蛋白发现，该浓度红景天可以诱导A549／DDP细胞的凋亡发生，且作用呈时间依赖性，48小时凋亡率可达（33.64±5.12）%；凋亡相关蛋白cleaved－caspase3及cleaved PARP的表达水平增加。有研究表明，红景天可能通过下调肿瘤组织中 CD4＋CD25＋Treg 比 例、Foxp3 和 TGF－βmRNA的表达，增强机体的抗肿瘤免疫应答，抑制Lewis肺癌小鼠移植瘤的生长[10]。

综上，本研究表明，红景天对多药耐药肺癌细胞抑制增殖、促进凋亡的作用；此外，有研究表明红景天能增强肺癌抗肿瘤免疫应答[10]，提示红景天可能在化疗耐药的肺癌治疗中有一定的应用前景。

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