四君子汤对脾虚大鼠肠黏膜TFF3蛋白表达及TFF3mRNA表达的影响

张 博，窦逾常，王垂杰

（1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳110032；2.吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033；

3.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳110033）

祖国医学认为，脾主运化，为后天之本，气血生化之源。脾为人体正常生命活动提供必需的营养物质，维持人体的内外平衡。脾虚是全身性的综合病理状态，与消化系统疾病发生的关系最为密切，主要表现为消化系统功能的减退和紊乱等。脾虚状态下，肠道黏膜屏障功能紊乱，出现病理性损伤[1]。三叶因子（TFFs，Trefoilfactors）是一族富含半胱氨酸的小分子多肽。其中小肠三叶因子（TFF3或ITF）具有很强的细胞保护作用，能促进胃肠黏膜细胞增殖，还能同胃肠黏液中的糖蛋白结合、稳定黏液屏障，因而在减轻肠道损害，促进肠道修复方面占据重要地位[2]。四君子汤是临床上用于脾虚证治疗的代表方剂，本研究通过观察脾虚大鼠肠黏膜TFF3蛋白表达及TFF3mRNA表达的变化，及四君子汤对其影响，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物分组

SPF级SD大鼠20只，体重250g左右。雌雄各半，分笼，标准饲料喂养1周后按随机数字表法分成4组，即正常对照组、脾虚模型组、自然复健组和四君子汤组。除正常对照组外，其余3组均制作大鼠长期脾虚模型。① 正常对照组大鼠常规喂养，生理盐水4ml／（次·只）灌胃，隔日1次，共7周。②脾虚模型组大鼠小承气汤（1.5ml／100g）灌胃，当日禁食不禁水，隔日1次，同时隔日足量喂食且游泳至耐力极限1次（以口鼻首次没入水中为准），共7周。③自然复健组喂养方法前4周同脾虚模型组，4周后改为常规饲养，共7周。④四君子汤组喂养方法前4周同脾虚模型组；4周后改为常规饲养，同时用四君子汤灌胃3周，（1.5ml／100g），每日1次。于实验7周末处死大鼠后取材处理。于实验7周末处死大鼠，取出3cm回肠黏膜组织，用0.9% 生理盐水冲洗干净，冰上刮取肠黏膜，放至内－80℃冰箱保存备用。

1.2 主要仪器与试剂

电子天平，JY5002型，0.01g－500g，上海精密科学仪器有限公司生产。电子天平，BS223S型，0.001g－220g，北京赛多利斯仪器系统有统公司生产。电热恒温培养箱，HH·B11·500型，上海跃进医疗器械厂生产。微量移液器，美国热电公司生产。PCR仪，BIO－RAD型，美国BIO公司生产。电泳仪，北京六一仪器设备厂生产。

总RNA 提取试 剂、RT－PCR 试 剂 盒、DNA marker购自北京全式金生物技术有限公司。引物由北京三博远志生物科技有限公司代为合成。亲和纯化兔抗大鼠多克隆抗体购自美国santa公司，羊抗兔二抗、蛋白marker购自北京全式金生物技术有限公司。小承气汤由厚朴、枳实、大黄（比例3∶3∶2）组成；四君子汤由党参、白术、茯苓、甘草（比例2∶2∶2∶1）组成，均由辽宁中医药大学附属医院药剂科提供，并由该院制剂室制成100%煎剂。

1.3 测定方法

1.3.1 肠黏膜TFF3蛋白表达的测定

蛋白印迹（Western－Blot）法测定回肠组织中TFF3蛋白表达的变化：按组织净重与裂解液1∶10的比例加入蛋白提取试剂，并用玻璃匀浆器在冰上进行匀浆，匀浆后静置于冰上20min，10 000转／分进行离心，离心15min，分离上清液即为总蛋白备用。采用考马斯亮蓝法对各组总蛋白进行蛋白定量，每孔上样20μg总蛋白进行电泳，半干转印法将蛋白转至PVDF膜，一抗（1∶200）4℃孵育过夜、二抗（1∶2 000）室温孵育1h，ECL发光，胶片曝光，扫描胶片，分别测定目的蛋白条带和内参蛋白条带灰度值，以目的条带灰度值／内参条带灰度值比值作为统计量，分析蛋白表达情况。

1.3.2 TFF3mRNA表达的测定

采用RT－PCR方法对各组大鼠回肠黏膜组织TFF3mRNA表达水平进行检测：TFF3上游引物5－AGCCCAGGAATTTGTTGGCC－3，下游引物5－TCAAAATGTACATTCTGTCT－3，扩增片段长度184bp。以GAPDH做为内参，（基因号：X02231），GAPDH 游 引 物 为 5′GCTGGTGCTGAGTATGTCGT，下游引物5′GAATGGGAGTTGCTGTTGAA，扩增片段长度608bp。凝胶成像分析系统采集图像，并测定目的基因条带和内参基因条带的积分光密度值，以目的条带积分光密度值／内参基因积分光密度值的比值作为统计数据，进行TFF3mRNA表达水平分析。

1.4 统计学方法

应用SPSS10.0软件进行统计学处理。所测得数据均以“均数±标准差”（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 与空白对照组相比，脾虚各组肠组织中TFF3蛋白的表达均有下降，其中四君子汤组TFF3蛋白的表达高于自然复健组及脾虚模型组，差异有统计学意义 （P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠回肠组织中TFF3蛋白的表达

2.2 与空白对照组相比，脾虚各组肠组织中TFF3 mRNA的表达均下降，其中四君子汤组TFF3mRNA的表达优于自然复健组及长期脾虚模型组，差异有统计学意义 （P＜0.01）。见表2，图1。

表2 各组大鼠回肠组织中TFF3mRNA的表达

图1 各组大鼠回肠组织中TFF3mRNA的表达

3 讨论

肠三叶因子（TFF3或ITF intestinal trefoil factor）是三叶肽家族成员之一，由肠黏膜上皮杯状细胞分泌，广泛存在于胃肠道，与MUC2等在肠黏膜中相互链接，在黏膜中构成网络状结构，抵抗胃肠道酸流，蛋白酶降解和机械损伤，从而保护肠黏膜免受损害[3]。同时，TFF3可以驱动受损黏膜周围完好的上皮细胞向黏膜损伤表面迁移覆盖，加速损伤修复，且TFF3较EGF引起的细胞迁徙，能减少细胞间隙的产生，更能精密修复黏膜损伤部位[4]，保持肠黏膜完整。TFF3能促进NF－κB的活性，从而增强ICE－18细胞的抗凋亡能力；而PI3－K／Akt途径促进了TFF3和MUC2在小肠上皮细胞的表达，TFF3又能反过激活PI3－K／Akt途径，以此来下调Caspase－3／9的活性[5]。研究表明，TFF3在抑制肠道黏膜凋亡、杯状细胞的分化中也起着重要作用，从而对黏膜起到保护作用。另外，有研究发现，TFF3可能通过促进环氧化酶－2合成，继而促进前列腺素－2生成，从而避免氧化应激对上皮细胞的损伤，来发挥细胞保护作用[6]。借助Scr和激活STAT3诱导血管内皮生长因子表达，有助于细胞的重建[7]。TFF3被认为是内源性具有抗凋亡特性的肽类物质，在肠道的自我保护和损伤后修复中占有重要地位。

脾虚证大鼠出现胃肠黏膜上皮局灶坏死脱落，炎性渗出，胃腺、肠腺萎缩，肠黏膜上皮坏死脱落。上皮细胞内含有大量自噬泡，腺体萎缩。黏膜下层水肿，细胞排列疏松。肠黏膜微绒毛排列稀疏紊乱，长短不一[8]。黏膜上皮内淋巴细胞和杯状细胞数量均显著增加，绒毛顶端与黏膜下层TLR2表达量均显著降低[9]。证明脾虚大鼠肠黏膜存在病理器质性损伤，进而可能引起肠黏膜功能损害。

本文观察到与空白对照组相比，脾虚各组大鼠肠黏膜TFF3蛋白表达及TFF3mRNA表达显著下调，这提示脾虚状态下大鼠肠黏膜病理器质性损伤，防御能力减弱。四君子汤组经治疗后TFF3蛋白表达及TFF3mRNA表达明显增加，优于自然复健组及长期脾虚模型组，提示四君子汤可增强TFF3mRNA与蛋白的表达，这一结果也表明四君子汤能够促进受损肠黏膜细胞的修复，增强肠黏膜防御能力。从而对肠黏膜屏障发挥调节作用。

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