益生菌对溃疡性结肠炎大鼠IL-1β、CD44的作用

王 雪，颜 玉，任秀英，鲍秀琦，姜 威

（佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003）

溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）是一种病因不明的慢性非特异性炎性疾病，主要累及直肠和结肠，从末端结肠开始，逆行性向近段发展，呈连续性分布，甚至累及全结肠和末端回肠，溃疡性结肠炎的特点在于溃疡的形成，主要病变集中在大肠黏膜及黏膜下层，UC 的患者主要临床表现轻重不等，多表现为腹泻，黏液脓血便，腹痛，里急后重，反复发作，长期迁延不愈的慢性过程。溃疡性结肠炎在西方国家发病率较高，亚洲较少，随着人们生活水平的提高，该病的患病率在我国有上升趋势［1］。令人遗憾的是，UC 的病因及发病机制还未明确，且缺乏特效的治疗方法，本实验通过检测UC大鼠血清IL-1β、CD44的变化，来探讨益生菌治疗UC 的机制，为益生菌在临床上的应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验药物

惠迪（美沙拉嗪肠溶片）：厂家：佳木斯鹿灵制药有限公司，批号：国药准字H19980148，主要成分：美沙拉嗪，规格：0.25g／片；美肠安（枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊）：厂家：北京韩美药品有限公司，批号：国药准字S20030087，成分：枯草杆菌及粪肠球菌二联活菌制剂，规格：250mg／粒；36%乙酸；石蜡油；乙醚。

1.2 药物剂量

1片美沙拉嗪肠溶片研磨溶于6mL蒸馏水制成混悬液；1粒美肠安胶囊去壳后溶于16mL 蒸馏水；将36%乙酸用生理盐水稀释为5%乙酸溶液。

1.3 试剂

IL-1β试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；CD44试剂盒（上海晨易生物科技有限公司）。

1.4 动物模型的建立及给药方法

健康Wistar大鼠32只，雌雄各半，体质量（200±20）g，清洁级，由大连医科大学实验动物中心提供，随机分成4组，每组8只，正常组（G1）、模型组（G2）、美沙拉嗪组（G3）、美肠安联合美沙拉嗪组（G4）。正常组常规饲养，不造模，其余各组大鼠禁食不禁水24h，乙醚麻醉后，用直径2mm 的橡胶导管插入距肛门约8cm 处的肠腔内，将5%乙酸溶液按0.25mL／100g缓慢推入，将大鼠倒置20秒后用生理盐水冲洗两次，之后常规饲养，制备UC 大鼠模型，24h后给药，G1、G2组：每只每天生理盐水2mL 灌胃；G3组：每只每天美沙拉嗪溶液2mL灌胃；G4组：每只每天美肠安溶液2mL灌胃（上午9时），美沙拉嗪溶液2mL灌胃（下午5时），每天各组大鼠用药时间相同。连续用药7d，7d后处死各组大鼠。

1.5 标本的采集

乙醚麻醉下经腹主动脉采血4mL，4℃冰箱中静置，打开腹腔，分离出全结肠，选择结肠病变最严重的部位剪取1cm×1cm，放入10%甲醛固定，用80%，90%，95%，100%乙醇进行梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，进行石蜡切片。

1.6 大鼠血清IL-1β及CD44的测定

3h后冰箱中取出血浆，3000rpm 离心15min，留取血清，通过ELISA 法测定大鼠血清IL-1β及CD44的表达，采集数据。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 大体观察

G1组：结肠黏膜表面光滑，未见黏膜充血、糜烂及溃疡，肠管未增厚。G2组：结肠黏膜粗糙不光滑，明显充血、水肿，表面有脓性分泌物，可见糜烂、溃疡、出血，肠壁增厚。G3组：结肠黏膜不光滑，呈颗粒状，充血水肿程度减轻，溃疡表面愈合明显，可见点状出血。G4组：结肠黏膜表面光滑，轻度充血水肿，未见明显溃疡，肠壁增厚减轻。

2.2 显微镜下观察

G1组：结肠黏膜结构清晰完整，黏膜下血管纹理清晰，腺体结构排列规则，上皮细胞排列整齐，未见充血水肿、糜烂溃疡。G2组：黏膜上皮大量坏死脱落，形成溃疡及不同程度灶性糜烂，固有层大量炎性细胞浸润，腺体破坏，可见隐窝脓肿。G3组：黏膜上皮缺损相对减轻，黏膜充血水肿减轻，可见浅溃疡及灶性糜烂，糜烂较小较浅，部分已经愈合，炎性细胞浸润程度减轻，腺体增生。G4组：黏膜上皮缺损明显减轻，基本正常，有少量炎性细胞浸润，可见轻微充血水肿，肉芽组织增生。

2.3 大鼠血清IL-1β、CD44的含量测定

见表1。

表1 大鼠血清IL-1β和CD44的测定结果（pg／mL，±s）

表1 大鼠血清IL-1β和CD44的测定结果（pg／mL，±s）

注：与正常组（G1）比较，＊P＜0.05；与模型组（G2）比较，＃ P＜0.05；与美沙拉嗪组（G3）比较，＆P＜0.05；模型组大鼠在治疗过程中死亡一只。

表中4组资料的IL-1β含量差异具有显著性（P＜0.05）：G2组高于G1组，差异有统计学意义（P＜0.05）；G4组与G3组均低于G2组，差异有统 计学意义（P＜0.05），其中G4组IL-1β的表达较G3组IL-1β的表达降低更明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。表中4组资料的CD44含量差异具有显著性（P＜0.05）：G2组高于G1组，差异有统计学意义（P＜0.05）；G4组与G3组均低于G2组，差异有统计学意义（P＜0.05），其中G4组CD44的表达较G3组CD44的表达降低更明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

IL-1由主要巨噬细胞产生，B 细胞、NK 细胞、内皮细胞或成纤维细胞等有核细胞也可产生IL-1。IL-1调节免疫反应，促进炎症细胞释放而发挥作用。IL-1家族分三类，包括IL-1α、IL-1β和IL-1受体拮抗剂（IL-1Ra），其中IL-1β是很强的促炎细胞因子，在IL-1家族起重要作用。IL-1β基因位于染色体2q13-14，与IL-1α和IL-1Ra基因共同分布于430kb的区域内并紧密连锁［2］。近年来，IL-1基因的多态性与UC的关系备受国内外学者重视［3］，目前，对IL-1β基因多态性的研究主要集中在31，511，3953等位点，研究结果不一，可能与研究对象种族差异有关。最新研究表明，IL-1β基因+3962C／T 位点存在单核苷酸多态性，其单核苷酸多态性基因结构的变化可能与其调节功能密切相关。IL-1β包含153个氨基酸，在UC 中与抗原协同对肠粘膜局部发挥作用，使T 细胞活化，促进单核-巨噬细胞等抗原提呈细胞的抗原表达，引起释放炎症介质。IL-1β和IL-1受体的失衡是UC发生的重要环节［4］，研究表明，肠上皮细胞（IECs）参加肠的免疫系统，其能分泌IL-1Ra但不分泌IL-1β，而炎症细胞由固有膜单核细胞（LPMC）分泌，所以ICEs分泌的IL-1Ra不能完全抵抗LPMC 分泌的IL-1β等炎症细胞因子［5］。研究发现，隐窝炎症表示UC 正处于活动期，发生隐窝炎症时，IL-1β的含量与免疫球蛋白、白蛋白及α-抗胰蛋白酶等标记蛋白丢失的量呈正相关［6］，故IL-1β的含量对判断UC的病情有重要意义。

细胞黏附因子是位于细胞膜表面的糖蛋白分子，研究发现它与UC有密切关系，在炎症免疫过程中受到人们重视。UC的肠道炎症主要是白细胞浸润到肠壁，而黏附因子在炎症细胞的浸润中起着重要作用。CD44广泛表达于多种细胞表面的糖蛋白，又称为黏附因子吞噬细胞膜糖蛋白，分子量为85KD-250KD的单链糖蛋白，作用是介导细胞、细胞外基质之间和细胞之间黏附。基因转录过程中mRNA 的选择性剪接形成标准型（CD44S）、变异型（CD44V1-10），称之为CD44家族。可与多种配体结合，有广泛的生物学活性。CD44介导淋巴细胞与毛细血管网小静脉中的内皮细胞结合，引导淋巴细胞穿透血管壁，通过激活淋巴细胞，参与淋巴细胞归位到淋巴组织，引起T 淋巴细胞活化，参与炎症反应。黏附因子CD44可以反映溃疡性结肠炎的严重程度，对UC病情的判断及药物疗效的观察都有重要作用。美常安，即枯草杆菌和粪肠球菌复合制剂，属于人体的有益菌，枯草杆菌是耐酸菌属，而粪肠球菌是耐胆盐菌，两者结合明显提高了在胃肠道的存活率，从而协同发挥最大的生物学作用。本实验通过美肠安联合美沙拉嗪治疗大鼠溃疡性结肠炎模型显示，美肠安和美沙拉嗪联合治疗组较美沙拉嗪治疗组光镜下改变趋于正常（P＜0.05）；IL-1β及CD44的表达均低于模型组（P＜0.05），而且效果明显优于美沙拉嗪单独用药（P＜0.05）。美肠安和美沙拉嗪联合用药治疗结果表明，美肠安可能是通过补充UC时肠道减少的有益菌群，增加黏液分泌，抑制肠上皮细胞的凋亡，调节肠道免疫功能，增强肠道黏膜屏障，阻止病原菌的侵袭从而治疗溃疡性结肠炎。美肠安联合美沙拉嗪治疗UC 可能是通过不同抑制IL-1β和CD44的表达，共同协同调节炎性因子的致病性，促进免疫功能的恢复。

［1］Yun J，Xu CT，Pan BR.Epidemiology and gene markers of ulcerative colitis in zhe Chinese［J］.World J Gastroenterol，2009，15（7）：788-803

［2］Dinarello CA.Biologic basis for interleukin-1in disease［J］.Blood，1996，87（6）：2095-2147

［3］TountsNA，CasiniRV，YangHY，et al.Functional and ethnic of allele-2of the interleukin-1receptor antagonistgene in ulcerative colitis［J］.Gastroenterology，1999，117：806-813

［4］Nemetz A，Kope A，Molnar T，et al.Significant differences in the interleukin-1beta and interleukin-1receptor antagonist gene polymorphisms in a Hungarian population with inflammatory bowel disease［J］.Scand J Gastroenterol，1999，34（2）：175-179

［5］Diag R，Rogler G，Aschenbrenner E，et al.Human intestinal cells secrete interlukin-1receptor antagonist and interlukin-8but not interleukin-1or interleukin-6［J］.Gut，2000，46（3）：350-358

［6］Evgenikos N，Bartolo DC，Hamer-Hodges DW，et al.Assessment of ileoanal pouch inflammation by interleukin-1beta and interleukin-8concentrations in the gut lumen［J］.Dis Colon Rectum，2002，45（2）：249-255