PK7300全自动血型分析仪测定ABO 血型抗体效价的初步研究

石绍川，刘东，李军，田耘博，陈鹏（重庆市血液中心 400015）

血型检测是无偿献血筛检的重要检测项目，长期以来，血站的血型检测主要采用手工操作的纸片法。但随着检测技术的迅猛发展，纸片法已不能满足实验室快速、准确、标准化、自动化的要求，其检测的各个环节逐步被相应的自动化设备所替代［1－2］。Olympus PK7300全自动血型分析仪集自动加样、孵育、判读、数据保存及全过程监控为一体，近年来我国的一些血液中心和中心血站陆续引进了该设备。本中心检验科自2011年将PK7300血型分析仪用于ABO 和Rh（D）血型的常规检测，在使用过程中，作者发现该仪器除具有全自动、高通量等优点外，其在不规则抗体和亚型筛选、测定ABO 血型抗体效价等方面也体现出较为卓越的性能，但将其用于测定ABO 血型抗体效价的报道较少。为此，本文对应用PK7300全自动血型分析仪测定ABO 血型抗体效价进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 标本来源选择本中心检验科2013年5～7月无偿献血者的血液检测标本。随机抽取日常检测后的标本A型、B型、O型各10例，进行ABO 血型抗体效价测定，并对检测出的ABO 血型抗体效价降低的情况进行统计分析。

1.2 仪器白洋600A型离心机、eppendorf 100～1000μL可调移液器、Olympus PK7300全自动血型分析仪。

1.3 试剂抗RhD－IgM（德国Biotest公司），单克隆抗A、抗B标准血清（上海血液生物医药有限责任公司）；反定型用红细胞试剂（上海血液生物医药有限责任公司）；生理盐水（四川南格尔生物医学股份有限公司）。以上试剂均鉴定合格，在有效期内使用。

1.4 方法

1.4.1 仪器微板法测定抽样样本的ABO 血型抗体效价随机抽取日常检测后的标本A型、B型、O型各10例，分别对每例标本的血浆用生理盐水进行1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶60、1∶80稀释；启动PK7300，按要求放入工作试剂，将上述每例稀释的血浆标本依次装入专用样本架的第2～8位，样本架的第1位装入未稀释的原标本（2500r／min 离心10 min，下层为红细胞），然后将样本架安装至血型分析仪的进样单元，血型分析仪自动进样并检测各个试验微孔的凝集情况，自动判读各标本的RhD 血型及ABO 血型。根据仪器检测的各个测试孔的凝集情况，以与试剂红细胞发生阳性凝集的血浆标本中最大稀释倍数者的稀释倍数作为该抽样标本的相应血型抗体的效价。

1.4.2 仪器微板法及手工试管法测定各血型混合血浆的ABO 血型抗体效价按血型不同在上述各例抽样标本中分别取100μL血浆标本混合配制成A型、B型、O型混合血浆。仪器微板法测定A型、B型、O型混合血浆的ABO 血型抗体效价（但各样本架的第1位装入的未稀释标本下层无红细胞）。将仪器微板法中使用的未稀释及稀释的混合血浆标本用手工试管法测定各型混合血浆的ABO 血型抗体效价：准备两个试管架及适量透明洁净的小试管并标记，在试管架一中以100μL血浆加2滴试剂红细胞的比例向各试验试管底部加入待测血浆及试剂红细胞（简称试管法一，此方法为本中心现行标准操作规程的操作方法），在试管架二中以100μL血浆加1滴试剂红细胞的比例向各试验试管底部加入待测血浆及试剂红细胞（简称试管法二，此方法为本研究中的一种对比方法），其中A型混合血浆加BC，B型混合血浆加A1C，O型混合血浆分别加A1C和BC，混匀各管，以1000r／min离心1min，按照临床检验操作规程的凝集强度判断标准判读各试验管的凝集情况［3］，将1＋以上凝集视为阳性凝集，以与试剂红细胞发生阳性凝集的混合血浆标本中最大稀释倍数者的稀释倍数作为该型混合血浆相应血型抗体的效价。

1.4.3 分析本中心2013年5～7月检测出的ABO 血型抗体效价降低的情况在本中心检验科的日常血型检测中，如遇到因为ABO 血型抗体效价降低而导致仪器不能正确判读标本血型时，则取该标本用试管法检测其正反定型，如正反定型相符则以试管法检测的结果报告，如正反定型不符或凝集强度仍降低，则送检到输血研究室进一步做ABO 血型确认试验；试管法或送检到输血研究室的确认检测均予以登记记录。依据试管法或送检的确认检测登记表及微板图像查找本中心2013年5～7月检测出的ABO 血型抗体效价降低的情况，对ABO血型抗体效价降低的献血者信息进行统计分析。

1.5 统计学处理采用SPSS19.0统计软件进行分析处理，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 仪器微板法测定抽样标本的ABO 血型抗体效价的结果见表1。作者分别用两种统计方法对该效价结果进行了统计分析。将效价值取对数后进行t检验的结果：A型与B型比较的P值为0.619，A型与O型比较的P值为0.059，B型与O型比较的P值为0.014。Mann－Whitney秩和检验结果：A型与B型比较的P值为0.425，A型与O型比较的P值为0.017，B型与O型比较的P值为0.005。

2.2 仪器微板法及手工试管法测定各血型混合血浆的ABO血型抗体效价的凝集反应情况见表2。其中，仪器微板法的凝集反应情况结果类型有＋、－、？3种；手工试管法的凝集反应情况结果类型有4＋、3＋、2＋、1＋、±、MF（mixed field，混合凝集外观）、－等7种。对3种方法测定的抗体效价结果进行Friedman秩和检验，P值为0.018。

2.3 本中心2013年5～7月共检出ABO 血型抗体效价降低的献血者43例，按血型分A型（抗－B 降低）33例、B型（抗－A降低）5例、O型（抗－A 降低2例及抗－B降低3例）5例，按性别分男35例、女8例，按年龄分18～＜25岁6例、25～＜35岁10例、35～＜45岁13例、45～＜55岁14例。本中心2013年5～7月的献血者共计22639人次，按血型分A型7172人次、B型5629人次、O型7940人次、AB型1898人次；按性别分男12847人次、女9792人次。ABO 血型抗体降低的献血者χ2检验结果：A型与B型比较的P值为0.000，A型与O型比较的P值为0.000，B型与O型比较的P值为0.821；男性与女性比较的P值为0.001。

表1 PK7300仪器微板法测定抽样样本的ABO 血型抗体效价的频数分布及均数

表2 仪器微板法及手工试管法测定各血型混合血浆的ABO 血型抗体效价的凝集反应情况

续表2 仪器微板法及手工试管法测定各血型混合血浆的ABO 血型抗体效价的凝集反应情况

3 讨论

在疑难血型鉴定和输血安全评估中通常会测定IgM 类血型抗体的效价，但传统的试管法操作繁琐、结果判读易受操作者主观因素的影响；用PK7300仪器微板法测定ABO 血型抗体（IgM 类）效价操作简便、结果判读客观、重复性好。测定ABO 和Rh（D）血型时，PK7300吸样后均在稀释杯中对血球和血浆样本进行自动稀释后再加样到微孔板与相应的稀释工作试剂进行抗原抗体反应，在厂家建议的参数设置中，血球样本经仪器自动稀释后的浓度为1.7%，血浆样本经仪器自动稀释后的稀释倍数为1∶20。本研究显示，尽管PK7300吸样后在稀释杯中对血浆样本进行1∶20自动稀释后再加样到微孔板进行抗原抗体反应，但多数（24／30）抽样标本血浆在事先预稀释5～80倍的条件下（总稀释倍数则为100～1600倍）其凝集反应仍能被仪器正确判读，可见微板法具有较高的灵敏度；张悦等［4］研究亦表明，微板法的判读正确率高于血站检验科常用的手工纸片法。用PK7300测定抽样样本及混合血浆的ABO血型抗体效价时，将血浆标本的稀释比例范围确定为1∶1～1∶80，该范围能满足绝大多数标本的测定需要；采用梯度稀释而非对倍稀释，这样有助于减小测定误差，测得较为准确的效价结果。

对比本研究中仪器微板法与两种手工试管法测定各血型混合血浆的ABO 血型抗体效价的凝集反应情况可以看出，手工试管法的灵敏度明显优于仪器微板法，而手工试管法二的灵敏度又明显优于手工试管法一。目前，试管法、玻片法、瓷板法、纸片法、微板法、凝胶卡法、聚合酶链反应法等多种方法可用于ABO 血型定型，但经典的试管离心法仍被认为是最可信赖的ABO 定型方法［5－7］。临床检验操作规程有关试管法ABO血型鉴定中要求正定型标本红细胞或反定型试剂红细胞的浓度为5%［3］；本研究中所用的试剂红细胞（购自上海血液生物医药有限责任公司），厂家说明书中未标明其具体浓度，据推算其浓度约为2.5%；在本研究有关手工试管法测定各血型混合血浆的ABO 血型抗体效价的部分，作者在临床检验操作规程的基础上对试剂红细胞的浓度以及血浆与试剂红细胞的比例进行了调整，试验结果表明，试管法二（约2滴标本血浆加1滴2.5%试剂红细胞的比例）具有更高的灵敏度，也更便于观察判定凝集反应情况，从而有助于减少因ABO 血型抗体效价降低而导致的抗体漏检。在使用PK7300对献血者标本进行血型筛查检测时，如遇到正反定型不符等可疑结果时，用试管法进行复核检测有助于及时确定标本血型、及时发布检测报告。

本文表1中计算的效价几何均数及算术均数与表2中仪器微板法测定的混合血浆的效价进了比较，结果发现3个值呈递增关系，而算术均数与混合血浆的效价更接近。说明抗体效价的几何均数主要是针对人群的集中趋势而言，而不是人群或个体的平均水平。作者分别用两种统计方法（将效价值取对数后进行t检验及直接将效价值进行秩和检验）对仪器微板法测定A、B、O 3种血型抽样标本的ABO 血型抗体效价进行了比较，结果显示，所抽样的O型献血者的ABO 血型抗体效价高于A型或B型；但两种统计方法的结果存在一定差异，作者认为抽样标本量较少可能是导致这种差异最主要的原因。

标本血浆的ABO 血型抗体（IgM 类）效价降低是导致PK7300不能正确判读标本血型（因正反定型不符）的最常见原因之一。本中心2013年5～7月因标本血浆的ABO 血型抗体效价降低所导致的PK7300不能正确判读标本血型，则是A型明显多于B型或O型，男性明显多于女性；因未获得不同年龄组献血人群的整体数据，本研究未对不同年龄组间血型抗体效价降低的差异进行统计分析，但结合本研究中抗体效价降低的例数及文献［8－9］有关献血人群年龄分布特征的调查结果，可以推断随着献血者年龄的增大，血型抗体效价降低者所占的比例体现出一定的增高趋势，与文献［5］中年龄因素对ABO 血型抗体水平的影响相符。需要提醒的是，对于ABO 血型抗体减弱的样本，除生理因素外，有部分是A／B亚型；如A（？）B含抗－A1抗体，其反定型与A1C反应较弱，正定型也可能只检出B抗原，定型结果为B型，正反定型相符；此处检出较弱的抗－A抗体，另外却漏检了A（？）抗原，导致正反定型伪相符，这种情况则需要进一步做有关亚型检测的相关试验予以确认［10－11］。

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