欧洲食品安全局(EFSA)细菌耐药性评估概述

赵婷，姚粟，徐友强，程池

(中国食品发酵工业研究院，中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京，100015)

细菌抗生素耐药性问题目前引起了国际国内的广泛关注，成为社会热点问题［1－3］。2014年，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)根据114个国家的数据进行调查，抗生素耐药性细菌正蔓延至全球各地［1］。大量不同种类的细菌用于食品或饲料的添加或生产，如发酵剂、益生菌等。这些微生物或微生物的代谢产物最终用于人体和动物，为了避免细菌抗生素耐药性向人体或动物的转移风险，必须评估这些微生物菌种的抗生素耐药性。2002年，国际粮农组织(Food and Agriculture Organization，FAO)和WHO提出食品中益生菌菌种安全性评价应包含抗生素耐药性检测［4］。2012年，《美国药典》(United States Pharmacopeia，USP)和《食品化学法典》(Food Chemicals Codex，FCC)关于包含益生菌的食品微生物菌种附录XV中，提出在菌种安全性评估方面应包含耐药性评估［5］。

欧洲食品安全局(European Food Safety Authority，EFSA)负责评估微生物菌种的安全性，安全资格认证(Qualified Presumption of Safety，QPS)列表中的微生物菌种，具有长期食用历史或经EFSA专家组科学评估为食用安全的菌种，其相关产品在特定用途时，上市前不需要再进行广泛的评估程序。2012年，EFSA更新了相关法规［6－7］，提出了食品及饲料工业用细菌抗生素耐药性评估体系，为国际范围内微生物菌种耐药性评估提供了标准参考方法。2013年，EFSA更新QPS列表［8］，提出将耐药性鉴定列为微生物菌种通用的安全评估项目，并采用统一的方法进行评估。

1 细菌耐药性定义

细菌耐药性指细菌对于抗菌药物作用的耐受性。当某一种抗生素耐药性是细菌物种所固有的特性时，它通常被称为“固有耐药性”，有时称为“自然耐药性”，即某一物种其所有菌株都具有该典型特性，相反，当一个物种的某个典型敏感菌株对某一种抗生素具有耐药性，被称为“获得性耐药性”。获得性耐药性可能是由于外源基因或原始菌株的自然突变引起［6，9－10］。

2 耐药性转移

耐药性转移至人或动物，可能源于使用具有耐药菌株的微生物产品或遗传因素。基于合理的假设，在开放的环境如肠胃中，基因可以从一种微生物转移至另外一种微生物，假定固有耐药性也存在小概率的潜在危害，而插入外源基因的获得性耐药性被认为具有很高的潜在危害及传播风险［10－11］。

外源基因插入是细菌间基因交换的结果。外源基因编码抗生素耐药性是存在的，尤其当存在转座子时，存在较大的耐药性传播风险。美国马里兰大学抗生素耐药性基因数据库ARDB［12］提供抗生素耐药性基因的检索、注释、分析功能，第一版更新至2009年7月，包括抗生素耐药性基因23 137个，抗生素249种，基因组632个，微生物种1 737个，微生物属267个。染色体基因突变引起的耐药性存在较低的耐药性传播风险［10－11］。原则上，作为食品或饲料添加剂使用的微生物，应尽可能地选择具有最低耐药性的菌株。

3 抗生素选择

所有用于食品或饲料添加剂的细菌必须建立相关菌株对人体和兽医上重要抗生素的敏感性数据。另外，测试方法应为国际认可并标准化的方法。抗生素的最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)以mg/L或μg/mL表示，需要测定的抗生素种类包括:氨苄青霉素、庆大霉素、卡那霉素、万古霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素、氯霉素，在特定的情况下包括泰乐菌素、阿泊拉霉素、萘啶酸、磺酰胺和甲氧苄氨嘧啶(见表1)，这些抗生素涵盖了广泛的抗生素种类［8］。

表1 微生物耐药性截止值(mg/L)Table 1 Microbiological antibiotic resistance cut－off values(mg/L)

4 微生物截止值(cut-off values)

为了从敏感菌株中区分耐药菌株，EFSA专家组定义了微生物截止值。微生物截止值的设置是通过研究同一个分类单元(种或属)细菌对不同抗生素耐药性的MIC值分布而得出。其中的一部分MIC值明显偏离正常敏感菌株的归类为耐药菌株。试验数据用于定义微生物截止值，如表1所示，数据来自欧洲委员会(European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases，EUCAST)大量微生物菌种样本对抗生素敏感试验［13］，该研究获得了欧洲监测项目资金支持。

评估这些作为食品或饲料添加剂使用的细菌，菌株可以归类为对抗生素敏感或耐药。敏感(S):当菌株被一定浓度的某种抗生素抑制，该浓度等于或低于已建立的截止值(S≤x mg/L)时，该菌株被定义对该抗生素敏感;耐药(R):当菌株不被一定浓度的某种抗生素抑制，该浓度高于已建立的截止值(S＞x mg/L)时，该菌株被定义为对该抗生素耐药。

确定的截止值用来从分离菌株中鉴定获得性耐药性细菌菌株，并且具有结果的一致性，这些截止值只被用来评估微生物相关产品可能存在的抗生素耐药性。

5 MIC值测定

为评估细菌菌株对抗生素的耐药性，采用琼脂或肉汤进行两倍梯度稀释，同时需要质控菌株进行验证。测试应该执行根据国际公认的标准，如临床和实验室标准研究院(clinical and laboratory standards institute，CLSI)标准［14－16］、国际标准化组织(international organization for standardization，ISO)标准［17］、德国标准化学会(deutsches Institut fǖr Normung，DIN)标准［18］等。经培养后，间接定性或半定性方法来确定MIC值，传统的琼脂扩散方法(Kirby-Bauer，KB)通常是不能接受的。现有的科学信息表明，测定特定或相关细菌菌株时必须考虑到MIC值测定程序，如稀释法、生长培养基和培养条件等，需按照程序操作，避免不同培养基或培养条件对结果造成的干扰。

6 基于遗传基础的耐药性

当检测MIC值高于截止值，EFSA专家组确定某菌株对一个或更多的抗生素耐药时，需要进一步调查以确定是否为自然耐药性。首先，需要区分获得性耐药性和固有耐药性。这只会出现在某分类单元MIC值数据信息有限或缺乏时，在这些情况下，必须阐明菌株的自然结构和基于遗传基础的耐药性，可选择该分类单元内一些具有代表性的菌株进行分析。因为固有耐药性是特定于细菌的属水平或种水平，所以首先需要用分子生物学的方法将菌株鉴定到种水平，当特定分类单元内的所有菌株均显示对某一抗生素具有表型耐药性，该耐药性可被认为是这一分类单元的固有耐药性。

当一个菌株声称与同一分类单元内的其他菌株相比对某一抗生素具有更高的耐药性时，表明存在获得性耐药性，这时，需要基于遗传基础的抗生素耐药性相关信息。唯一的例外是屎肠球菌(Enterococcus faecium)对氨苄青霉素的耐药性，菌株对氨苄西林MIC＞2 μg/mL时，不适合作为食品或饲料添加剂使用，这是由于医院对该菌株进行了特殊标记［19］。

获得性耐药性可能是由于获得外源基因或原有基因的突变。现有文献没有报道某菌株具有获得性耐药基因，并不足以说明该菌株安全。EFSA专家小组提出食品及饲料添加剂菌种的抗生素耐药性评估方法［8］，如图1 所示。

任何携带固有耐药性基因的细菌菌株，具有最小的潜在水平传播风险，因此，可用作食品或饲料添加剂;任何携带获得性耐药性基因的细菌菌株，如果是由于染色体突变引起的，具有较低的潜在水平传播风险，一般可用作食品或饲料添加剂;任何携带获得性耐药性基因的细菌菌株，如果是由于外源获得性基因引起的，具有极高的潜在水平传播风险，不能用作食品或饲料添加剂;在缺乏相关基于遗传基础的耐药性信息时，这些菌株不能用作食品或饲料添加剂。

图1 食品及饲料添加剂菌种耐药性评估流程Fig.1 Proposed scheme for the antimicrobial resistance assessment of a microorganism used in food or as a feed additive

对于QPS推荐的细菌来说，共同特点是不含耐药性编码基因。一般情况下QPS认为携带获得性耐药性的菌株不能添加到食品和饲料生产过程中，获得性耐药基因不完全列表见表2。

7 EFSA细菌耐药性评估体系对我国相关法规标准的借鉴意义

菌种耐药性与菌种毒力、菌种致病性等属于菌种安全性评价范畴［3］。我国在食品微生物菌种耐药性由国家食品药品监督管理总局(SFDA)、国家卫生与计划生育委员会(NHFPC)负责管理，饲料微生物菌种耐药性由中华人民共和国农业部(MOA)负责管理。

我国出台的涉及菌种耐药性评估的法规包括:2001年，卫生部关于印发《真菌类和益生菌类保健食品评审规定的通知》(卫法监发［2001］84 号)［20］第五条:“申报真菌类保健食品，除按卫生部保健食品申报与受理规定的要求提交资料外，还应提供菌种的安全性评价资料(包括毒力试验)。”2002年，卫生部关于印发《以酶制剂等为原料的保健食品评审规定的通知》(卫法监发［2002］100 号)［21］第二条:“使用微生物发酵直接生产保健食品的，除按保健食品申报与受理的规定提交相关资料外，还需提供菌种的安全性评价报告。”2011年，国家食品药品监督管理局(SFDA)发布《保健食品良好生产规范(修订稿)》征求意见(食药监保化函［2011］548 号)［22］，生产企业进行保健食品产品申报时，应遵循:“菌丝体原料、益生菌类原料和藻类原料采购应当索取菌株或品种鉴定报告、稳定性报告和不含耐药因子的证明材料。”2013年，卫计委印发《新食品原料申报与受理规定》和《新食品原料安全性审查规程》(国卫食品发〔2013〕23 号)［23］第十二条规定:“安全性评估报告应当包括微生物耐药性试验报告和产毒能力试验报告”等。

表2 获得性耐药基因不完全列表Table 2 Acquired antibiotic resistance gene part of the list

我国菌种耐药性检测标准包括:WS/T 125－1999纸片法抗菌药物敏感试验标准［24］，SN/T 1944－2007动物及其制品中细菌耐药性的测定纸片扩散法［25］。两者均为纸片扩散法，还未出台最低抑菌浓度法(MIC)耐药性评估方法标准，更未涉及基因水平耐药性检测。

食品安全是国际国内的热点问题，受到世界范围内的广泛关注。用于食品工业的微生物菌种的食用安全性也是其重要组成部分。微生物菌种的安全性评价包括菌种耐药性、菌种毒力、菌种致病性等。在微生物菌种耐药性评估方面，欧盟、美国等发达国家在监管、法规、标准、技术体系等方面都位于国际前列，MIC表型检测与耐药性基因检测相结合是食品及饲料微生物菌种耐药性评估的趋势，其对我国微生物菌种耐药性评估体系的规范与发展具有重要借鉴意义。

8 展望

近年来，随着全基因组测序的发展，基于全基因组测序挖掘、评估微生物菌种耐药基因也逐渐开展，2011年，丹麦科汉森公司(Chr.Hansen)［26］通过全基因组测序筛查了28株乳酸菌的获得性耐药基因及毒力因子基因，2008年，Heimbach等［27］认为蛋白相邻类聚簇(clusters of orthologous groups，COGs)V可能包含耐药基因，并分析了罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)DSM 17938全基因组COGs V。国际上已开发出 Etest® 、Neo-Sensitabs® 、Yeastone® 、Vitek® 、MIC T strip、VetMICTM等系列耐药性检测商业化衍生产品。我国学者也在中国传统发酵食品细菌耐药性评价方面做了有益的尝试［28－30］，食品种类包括酸奶、腌菜、香肠等，细菌种类涵盖乳酸杆菌(Lactobacillus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)等常见益生菌。课题组2012年采用CLSI M38-A2 MIC方法对保健食品生产菌株产孢小型丝状真菌蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)进行表型耐药性评估［31］。面对微生物耐药性可能引起的食品安全问题，相信未来会有越来越多的学者投入到微生物菌种耐药性评估研究工作中，EFSA细菌耐药性评估体系会持续更新，酵母、小型丝状真菌耐药性评估体系也会逐步建立，共同保障人类食品安全。

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