醋狼毒（月腺大戟）HPLC指纹图谱*

狄恒建，庄 果，李俊松**

1江苏省食品药品检验所，南京 210008；

2南京中医药大学江苏省中药炮制重点实验室，南京 210029

狼毒，大戟科植物月腺大戟Euphorbia ebracteolata Hayata.或狼毒大戟Euphorbia fischeriana Steud.的干燥根，始载于《神农本草经》，有毒，具有逐水祛痰、散结杀虫的功效[1]。狼毒生品药性峻烈，毒副性作用大，经醋炙后毒性降低，方可供临床上内服[2]。《中国药典》2010年版“狼毒”项下载有饮片生狼毒和醋狼毒；“生品”项下仅有性状、显微和薄层鉴别、杂质、水分、总灰分、浸出物和酸不溶性灰分等质控项目；“醋品”项下则无质控项目[3]。文献多采用测定月腺大戟中主要药效成分狼毒乙素和岩大戟内酯B等含量的方法来评价其质量的优劣[4-5]。

中药指纹图谱是采用一定的分析手段，得到能够标示其化学特征的色谱图[6-7]，其作为质量控制模式可以综合反映药材中各主要成分及其相对含量，能提供更加丰富的质量评价信息。为了更全面控制醋狼毒（月腺大戟）饮片质量，本研究采用HPLC法建立了醋狼毒（月腺大戟）指纹图谱。该方法可靠，重复性好，操作简便。仪（Agilent公司），含DAD检测器；AG285电子天平（瑞士Mettler公司）；KQ-3200E型超声清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

狼毒乙素、狼毒丙素对照品为本实验室自制，经波谱学方法鉴定结构，并由色谱法确定其纯度分别为99.0%和98.7%。

狼毒药材来源见表1，经南京中医药大学中药鉴定教研室刘训红教授鉴定为大戟科大戟属植物月腺大戟的干燥根；样品1～7号的醋炙饮片为本实验室按已考察过的炮制方法自制 （辅料醋用量为40%，闷润1 h至醋被吸收干净，160℃下炒制10 min）；样品8～10号为南京海昌中药饮片公司按本实验室提供方法炮制的中试放大产品。

甲醇为分析纯；乙腈为色谱纯；水为娃哈哈纯净水；醋为江苏镇江恒顺香醋 （总酸量≥4.5 g/100 mL）。

1 仪器及试药

1.1 仪器

Agilent1100四元泵全自动进样高效液相色谱

表1 样品来源

2 色谱条件

Welchorm-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流动相：乙腈（A%）-水（B%），梯度洗脱（0～10 min，10%～15%A；10～11 min，15%～33%A；11～20 min，33%～40%A；20～30 min，40%～66%A；30～40 min，66%～68%A；40～42 min，68%～70%A；42～45 min，70%～80%；45～50 min，80%～90%A；50～60 min，90%～90%A），平衡时间 5 min。 检测波长：226 nm；灵敏度：1.0 AUFS；柱温：25℃；流速：l mL·min-1；进样量：20 μL。

在上述色谱条件下，理论塔板数按狼毒乙素峰计算不小于3000。

3 溶液的制备

3.1 供试品溶液

取醋狼毒（月腺大戟）粉末（过6号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理 （功率250 w，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减少的重量，摇匀，滤过，精取续滤液用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液即得。

3.2 对照品溶液的制备

取狼毒乙素适量，精密称定，加甲醇制成每毫升含30 μg溶液，即得。

4 方法与结果

4.1 指纹图谱方法学考察

参考 《中药注射剂指纹图谱的技术研究 （暂行）》，考虑到各样品中均有狼毒乙素峰且含量较高，其保留时间及峰形稳定，分离度良好，故以此峰作为参照峰，计算醋月腺大戟HPLC指纹图谱中其他色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，考察方法学。

4.1.1 精密度试验精密吸取同一供试品溶液20 μL，连续进样6次，检测指纹图谱。

结果，各共有峰相对保留时间的RSD在0.02%～0.71%，相对峰面积RSD均小于3%，6次进样共有图谱的相似度均大于为0.96，精密度良好，符合指纹图谱要求。

4.1.2 重复性试验取同一批醋狼毒粉末5份，按“3.1”项下方法制备供试品溶液，分别检测指纹图谱。结果，以狼毒乙素峰的保留时间和峰面积为参照，各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于4%，5次进样共有图谱的相似度均大于0.99，重复性良好，符合指纹图谱要求。

4.1.3 稳定性试验取同一供试品溶液适量，分别于 0、2、4、8、12、24 h 检测指纹图谱。结果，各共有峰相对峰面积及相对保留时间的RSD＜3%，共有图谱的相似度＞0.9，供试液在24 h内稳定，符合指纹图谱要求。

4.2 醋狼毒（月腺大戟）指纹图谱共有模式的建立及相似度比较

4.2.1 醋狼毒（月腺大戟）指纹图谱及特征峰的标定对10批不同醋狼毒（月腺大戟）样品按“3.1”项下方法制备供试品溶液，分别进行测定，记录60 min内的色谱图。

采用 《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004年A版）》，对10批醋月腺大戟的指纹图谱进行考察，以保留时间约为26.55 min的12号色谱峰（狼毒乙素）作为参照峰，确定了23个共有特征指纹峰（见图1），10批供试品的叠加图见图2。

图1 醋狼毒（月腺大戟）HPLC指纹图谱

图2 醋狼毒（月腺大戟）10批供试品的共有模式图

4.2.2 醋狼毒相似度比较参考《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》，对10批醋狼毒指纹图谱进行相关技术参数的计算，结果显示其共有峰的相对保留时间的RSD均小于0.9%，相对峰面积的RSD均小于1.8%；通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》对醋狼毒（月腺大戟）10批饮片指纹图谱进行相似度评价，发现大多数样品相似度良好，平均相似度为0.962，结果见表2。

5 讨 论

5.1 采用不同溶剂（甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、水）、不同提取方法（回流提取和超声提取）及提取时间（20 min、30 min、60 min）对醋狼毒（月腺大戟）供试液提取方法进行考察，并根据指纹图谱对不同提取方法提取液进行分析，结果表明，用甲醇作为溶剂超声提取30 min就能够将醋月腺大戟中化学成分较完全提取出来，且此方法提取10批生品样品的相似度较好。

表2 10批醋狼毒 （月腺大戟）相似度计算结果

5.2 醋狼毒（月腺大戟）HPLC指纹图谱可靠，建立的方法学良好，反映了醋狼毒的整体特征，可用于醋狼毒（月腺大戟）质量控制和质量标准的建立。

[1]徐树楠，朱占民.神农本草经[M].石家庄：河北科学技术出版社，1994：131；1982：110.

[2]颜秉强，张永清.月腺大戟研究进展[J].山东中医药大学学报，2008，32（5）：432-5.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典 （一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：269

[4]乔春峰，韩全斌，贺震旦，等.RP-HPLC法测定狼毒中岩大戟内酯A和 B的含量 [J].药物分析杂志，2006，26（9）：1204-6.

[5]谢演晖，严小红，王灿坚，等.RP-HPLC法测定月腺大戟中狼毒乙素的含量 [J].中药材，2010，33 （4）：568-70；269.

[6]谢培山.中药色谱指纹图谱鉴别的概念、属性、技术与应用[J].中国中药杂志，2001，26（10）：653.

[7]国家药品监督管理局.中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）[J]. 中成药，2000，22（10）：671.