印度梨形孢增强棉苗对渍水胁迫的抗性

查凡+杨亚珍+汪敏等

摘要：用柯字棉Cocer312进行盆栽试验，研究印度梨形孢（Pirformaspore indica P.）对苗期渍水胁迫下棉花生长的影响，设置不渍水+不加菌、不渍水+苗龄15 d加菌、不渍水+苗龄45 d加菌、渍水+不加菌、渍水+苗龄15 d加菌及渍水+苗龄45 d加菌6种处理，分别在渍水胁迫前、胁迫解除时和胁迫解除10 d后取功能叶片测定相关指标。渍水胁迫对棉苗产生巨大危害，加入的印度梨形孢能定殖在棉花（Gossypium spp）根部，促进棉花的生长发育，并在一定程度上提高棉花对渍水逆境的抗性。而且在渍水逆境来临之前，该菌有效定殖更有利于诱导棉花的抗渍性。

关键词：印度梨形孢（Pirformaspore indica P.）；柯字棉Cocer312；渍水胁迫；酶活性；产量

中图分类号：S562 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）18-4276-06

印度梨形孢（Pirformaspore indica P.）是Verma等[1]在印度西北部塔尔沙漠中发现的一种内生真菌，属担子菌门（Basidiomycota）层菌纲（Agaricomycetes），蜡壳耳目（Sebacinales）蜡壳耳科（Sebacinaceae）梨形孢属（Piriformospora），只形成厚垣孢子，典型的孢子为梨形。目前已知该菌能在200多种植物上定殖，如禾本科水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays），豆科大豆（Glycine max）、鹰嘴豆（Chickpea），茄科茄子（Solanum melongena）、烟草（Nicotiana tabacum L.）以及玄参科的假马齿觉[Bacopa monnieri （L.） Wettst.]等，还能在如睡茄（Withania）、鸭嘴花（Adhatoda Vasica Nees）等具有重要经济价值的药用植物上定殖[2]，也能定殖于拟南芥（Arabidopsis thaliana）、花椰菜（Brassica oleracea L.var. botrytis L.）、芥菜[Brassica juncea （L.） Czern.et Coss.][3]、小白菜（Brassica rapa L.Chinensis Group.）[4]等非菌根真菌寄主的十字花科植物。印度梨形孢菌与菌根真菌（AM）类似，与植物共生后能促进植物生长，加快植物对氮、磷等矿物质的吸收，提高作物对逆境胁迫的忍耐性，诱导植物产生系统抗性[5]。印度梨形孢菌能通过调节抗氧化酶活性增强大麦（Hordeum vulgare L.）对高盐胁迫的耐性[6]，提高小白菜对干旱胁迫的耐性和对小白菜黑斑病的抗性[4]。与AM不同，印度梨形孢能在许多复杂的合成或半合成培养基上生长并得到纯培养物，而AM是营专性寄生的，不能纯培养。这为研究印度梨形孢与植物互作的分子基础提供了极大方便，并可能广泛应用于农林业和花卉园艺业[7]。

棉花（Gossypium spp）5月初移栽，苗期一般为40～50 d，该时期需水量为全生育期最少，土壤湿度保持田间持水量的55%～65%时对棉苗生长有利，如果田间排水不及时，易发生涝渍灾害，不利于棉花发育。江汉平原是重要的棉花主产区，棉花是该地区主要的旱地作物[8]，5-8月棉花正值苗期，也是该地区降水最为集中的时期，强降水往往导致较为严重的棉花减产等农业涝渍灾害[9]。前人对棉花涝渍的防治主要集中在棉田防涝排灌上[10，11]，对印度梨形孢菌提高植物抗逆性的研究，未涉及棉花在渍水逆境下该菌在促进棉花生长和提高抗逆性方面的应用，本研究试从生物防治角度利用印度梨形孢菌与棉花互作探讨预防棉花涝渍的新方法。

1 材料与方法

1.1 试验概况

试验采用盆栽模拟法。供试品种为柯字棉Cocer312，3月31日播种，营养钵育苗；4月15日（苗龄15 d）移栽于花盆（20 cm×12 cm×15 cm）中，每处理为20盆，每盆基质（棉花专用营养土∶蛭石∶河沙=5∶3∶2）约2.0 kg，每盆一苗。5月5-15日（苗龄35～45 d）将苗盆平放入水池中，加自来水进行渍水胁迫，以水位刚没过苗盆边沿为准；5月15日（苗龄45 d）将苗盆从水池中取出，并松土以尽快排水，停止渍水胁迫。

1.2 试验方法和数据处理

1.2.1 试验设计 设置6种处理，不渍水+不加菌处理（CK），不渍水+苗龄15 d加菌处理（*P），不渍水+苗龄45 d加菌处理（P*）；渍水+不加菌处理（W），渍水+苗龄15 d加菌处理（*PW）和渍水+苗龄45 d加菌处理（WP*）。

1.2.2 加菌与定殖检测 将斜面印度梨形孢菌接种在PDA平板上28 ℃暗培养5 d后，用直径1 cm打孔器钻取菌块接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，28 ℃ 200 r/min震荡培养一周；用搅拌机将培养物搅碎，稀释100倍，每盆加入100 mL稀释液。对照（CK）加等量去离子水。加菌15 d后，取根，洗净剪成约1 cm大小，10% KOH浸泡过夜，去离子水冲洗5～8遍，至于载玻片上，吸水纸吸干水分，滴取适量石碳酸棉兰染液，静置10 min。盖上盖玻片，按压，吸掉多余染液，在光学显微镜下观察。

1.2.3 相关指标测定与数据处理 移栽后每10 d测一次各处理植株总高，取平均值为株高；分别在渍水胁迫前（苗龄35 d）、胁迫解除时（苗龄45 d）、胁迫解除15 d后（苗龄60 d）于9：00-10：00取各处理棉花的功能叶片测定叶绿素含量、丙二醛（MDA）含量、SOD活性、POD活性。其中叶绿素含量测定采用丙酮/酒精提取法，MDA含量测定采用硫代巴比妥酸显色法，SOD活性测定用四氮唑蓝光化还原法，POD活性测定用愈创木酚氧化法，具体操作参照文献[12]。统计结桃铃数，10月30日结束试验。用SPSS软件进行方差分析和显著性分析，通过Microsoft Excel软件作图。

2 结果与分析

2.1 印度梨形孢菌在棉花根部的定殖

印度梨形孢菌与植物共生后，在根系中形成梨形厚垣孢子，可通过镜检观察其在植物根部的定殖情况。施用印度梨形孢菌悬液15 d后，在加菌的棉苗根中观察到梨形孢子，而在对照中未见（图1）。在对加菌的30份根样的镜检中发现，在根尖分生区和伸长区，从根皮层到中间均可见梨形孢子，并且孢子大量集中于中间区域；而在根尖成熟区及以上梨形孢存在于表皮细胞内，并不侵入根系中柱和导管区域。

2.2 印度梨形孢菌对株高的影响

无渍水胁迫时，印度梨形孢菌能促进棉苗株高的增长；渍水胁迫条件下，棉苗生长受到抑制，印度梨形孢菌的加入可降低胁迫对棉苗株高的抑制作用。由表1可知，苗龄25～35 d时，早期加菌（苗龄15d加菌）处理（*P和*PW）株高始终高于未加菌处理（CK、W）和后期加菌（苗龄45 d加菌）处理（P*和WP*），并且差异达到极显著水平；苗龄60 d时，后期加菌处理（P*和WP*）株高迅速增长，分别超过未渍水未加菌的CK和渍水未加菌的W，但分别不及早期加菌的*P和*PW。由此可知无论渍水与否，印度梨形孢菌均能显著促进棉苗的生长，并且早期加菌所产生的促进作用强于后期加菌。

由表1可知，渍水胁迫期间，苗龄45 d，无论加菌与否，渍水处理（W、*PW和WP*）株高增长均显著低于未渍水处理（CK、*P和P*），表明渍水胁迫严重抑制了棉苗生长。但苗龄15 d加菌处理（*PW）在苗龄35～45 d株高增长高于未加菌处理（W）和苗龄45 d加菌处理（WP*），表明早期加菌能缓解渍水胁迫对棉苗生长的抑制作用。渍水胁迫解除后，苗龄45～60 d，加菌处理（*PW和WP*）株高急剧增长且显著高于未加菌处理（W）（图2）。由此可见，无论是渍水胁迫前加菌还是胁迫解除后加菌，印度梨形孢菌均能促进棉苗生长，均能降低但不能完全消除渍水胁迫对棉苗生长的抑制作用，并且渍水胁迫前加菌更有利于提高棉苗对胁迫的抗性。

2.3 印度梨形孢菌对总叶绿素含量的影响

由图3可知，无渍水胁迫处理（CK、*P和P*）棉苗功能叶片总叶绿素的含量先上升之后基本维持不变，*P总叶绿素含量始终最高，P*与CK始终无明显差别。由图4可知，渍水胁迫过程中，苗龄45 d，W和WP*总叶绿素含量急剧下降，分别降低了38.89%和58.70%；*PW降低了10.06%。可见渍水胁迫导致棉苗功能叶片总叶绿素含量降低，这与梁哲军等[13]的试验结果一致。渍水胁迫解除后，苗龄60 d，WP*总叶绿素含量急剧上升（153.95%），显著高于W（66.12%）和*PW（24.77%）的增加值。比较图3和图4，早期加菌的棉苗*PW总叶绿素含量始终高于未加菌棉苗W（渍水胁迫条件下苗龄35 d除外）。结果表明，渍水胁迫使得处于生长时期的棉苗叶绿素含量大幅降低，而定殖有印度梨形孢菌的植株在胁迫过程中比未定殖印度梨形孢菌的植株更能维持总叶绿素含量；渍水后修复期加菌WP*的棉苗总叶绿素含量最初低于渍水前加菌的棉苗，但加菌棉苗呈现出比未加菌和渍水前加菌棉苗更强的叶绿素含量的恢复力，苗龄60 d时总叶绿素含量最高。

2.4 印度梨形孢菌对丙二醛（MDA）含量的影响

渍水胁迫条件下，叶片细胞膜中丙二醛（MDA）、可溶性糖（DS）和游离脯氨酸（Pro）等代谢副产物的生成显著高于正常水平。其中，MDA对组织细胞具有强烈的破坏作用，DS和Pro的增加可保护组织，增强抗逆性。MDA是植物体主要的膜脂过氧化产物之一，能够与细胞内各种成分发生强烈反应，从而引起酶和膜的严重损伤，其含量基本反映了植物遭受胁迫的程度。

在无渍水胁迫条件下，随着棉苗的生长，叶片也产生了微量的MDA并且3个处理间无明显差异，说明在正常灌水条件下加菌与否对MDA的产生无影响（图5）。在渍水胁迫过程中，棉苗产生大量MDA，明显多于未渍水胁迫处理，但*PW处理的MDA含量显著低于W、WP*，并略高于未渍水胁迫处理（图6），这说明渍水前印度梨形孢菌的定殖可以提高棉苗对胁迫的抗性，从而出现较低的膜脂过氧化程度；渍后修复期，各处理因胁迫解除植株进行自我修复，MDA含量均下降，W处理降低最为明显，WP*次之，*PW只是略有降低，这表明渍水胁迫对加入印度梨形孢菌的棉苗的危害远远低于未加菌的棉苗。综合分析可知，在渍水胁迫前加入印度梨形孢菌可提高棉花对胁迫的抵抗性，胁迫解除后追加印度梨形孢菌也可对渍水胁迫造成的危害起到缓解作用。

2.5 印度梨形孢菌对抗氧化酶活性的影响

2.5.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性 由图7可知，无渍水胁迫处理的棉花叶片SOD活性在3次测定中先降后升，与CK和P*相比，*P处理SOD活性的下降和升高更为明显，这可能是因为无渍水胁迫的棉苗在35～45 d期间不需要维持较高的SOD活性，而印度梨形孢菌早期的定殖使得这一过程SOD活性更低。苗龄45～60 d随着棉苗的生长SOD活性升高，此过程*P处理SOD活性迅速升高并最后与CK和P*处理相同，可能是因为在无渍水胁迫下印度梨形孢菌协助了棉苗随时增强或抑制SOD活性变化以利于植株生长发育。由图8可知，渍水过程中各处理棉苗叶片SOD活性均有所升高，说明棉苗为抵抗渍水胁迫而呈现较高的SOD活性以清除活性氧，是植物适应环境的表现。这一过程*PW处理SOD活性始终高于W和WP*，说明印度梨形孢菌的定殖可使棉苗在胁迫过程中维持较高的SOD活性以应对渍水逆境。而在渍后修复期，W处理棉苗的SOD活性急剧升高，表明渍水使得棉苗受害最为严重（与清水胁迫恢复期W处理MDA含量也较高相互印证），清水处理使棉苗产生过量活性氧，需要较高的SOD活性将其清除。*PW处理SOD活性略微降低，表明此时该处理棉苗不需要高SOD活性清除活性氧。WP*处理小幅升高，且一直低于W处理，但苗龄60 d时这两处理MDA含量同为最低（图6），说明渍后加菌可能是通过其他未知途径清除胁迫造成的危害。

2.5.2 超氧化物歧化酶（POD）活性 由图9可知，35～45 d期间未加菌的CK和P*处理POD活性均下降、加菌的*P处理POD活性升高，45～60 d加菌的*P和P*处理POD活性均下降、未加菌的CK处理POD活性升高，并且*P处理始终维持较高的POD活性。由图10可知，渍水胁迫过程中各处理POD活性均下降，*PW处理下降幅度小于W和WP*处理；渍后修复期*PW处理的POD活性基本维持不变，WP*处理POD活性增强幅度小于W处理。综合分析图9、图10可知，在苗龄35～45 d期间，无论渍水胁迫与否，各处理（除*P以外）棉苗叶片POD活性均会降低，且渍水加剧POD活性的降低，有印度梨形孢菌定殖的棉苗在未渍水胁迫处理下POD活性增强（图9，35～45 d，*P处理）并在渍水胁迫期间抑制POD活性的降低，这说明在此阶段印度梨形孢菌可促进棉苗维持相对较高的POD活性。在45～60 d期间，CK、W、WP*处理的POD活性都增强，且增幅W>WP*>CK，*P、P*处理的POD活性均减弱，*PW处理POD活性基本维持不变。

2.6 印度梨形孢菌对结铃数与铃重的影响

在后期的观察中发现，*P出现第一蕾时间最早，结桃结铃数最多；渍水胁迫使棉花出现第一蕾时间延迟，但*PW和WP*处理的这种延迟要弱于W。表2统计了各处理单株累计结桃数、结铃数、子棉重，计算平均单铃重和各处理相对于CK处理子棉总重的增产率，显示未渍水胁迫下加菌可增加棉花结桃数和结铃数从而提高产量，*P处理增产31.18%；渍水胁迫使得棉苗总结桃数、结铃数减少，W、*PW和WP*处理分别减产80.84%、36.67%、57.89%，说明加菌可减轻渍水胁迫造成的减产，且胁迫前加菌更有利于缓解减产。

3 小结与讨论

3.1 结论

未渍水胁迫下，印度梨形孢菌的定殖可促进柯子棉Cocer312株高和叶绿素的增长，该菌较早定殖促生效果更为明显。渍水胁迫导致棉苗总叶绿素含量急剧降低、株高增长受阻；定殖有印度梨形孢菌的棉苗能维持总叶绿素含量以保证光合作用对叶绿素的需求，株高增长受阻状况也得到一定程度的缓解。渍水胁迫解除后加入印度梨形孢菌也能促进棉苗株高和总叶绿素的增长，但效果不如渍水胁迫前加菌明显。

无渍水胁迫条件下棉苗产生极少量MDA，印度梨形孢菌对MDA产生无影响；胁迫前加菌的棉苗叶片MDA含量低于未加菌，较低的膜脂过氧化产物的含量说明印度梨形孢菌可增强棉苗对渍水逆境的抵抗性。渍水胁迫前加菌可使棉苗在胁迫期间维持较高的POD、SOD活性以利于清除活性氧的危害，并且酶活在修复期仍然维持相对稳定；修复期加菌SOD活性升高缓慢。

无渍水胁迫条件下印度梨形孢菌的定殖可增加棉花结桃数、结铃数和单铃重。渍水胁迫使棉苗总结桃数、结铃数减少，产量降低，加入印度梨形孢菌可减轻渍水胁迫造成的减产，且渍水胁迫前加印度梨形孢菌更有利于缓解减产。

3.2 讨论

根系缺氧是渍水胁迫对棉花植株产生的直接影响，根系在厌氧呼吸过程中生成大量还原性中间产物，不利于根系向地性生长，同时渍水胁迫也会对植株地上部分造成伤害，这是根系缺氧引起的次级伤害，使叶片内清除活性氧的酶保护系统活性被削弱，并导致膜脂过氧化作用加速。SOD、POD和CAT等活性酶组成了防御生物活性氧毒害的酶性保护系统，在植物体内起到清除活性氧的功能。一方面O2-2、HO-、O2-等活性氧自由基和H2O2大量产生，抑制保护性酶的活性；另一方面SOD、POD和CAT等保护酶的活性发生变化，促进或抑制活性氧代谢。一般认为，短期渍水过程中，渍水胁迫开始时棉花SOD活性增强，将O2-转化为对细胞毒性较轻的H2O2；而随着渍水胁迫时间延长，在胁迫后期POD、CAT为主要防御酶，将H2O2转化为无毒的H2O和O2[8]。Yang等[14]研究发现，定殖有印度梨形孢菌的湘杂棉F7在15 d渍水胁迫过程中棉花功能叶的SOD活性迅速增强，POD活性降低，而未加印度梨形孢菌的棉花POD活性增强。

棉花对渍水胁迫的反应是复杂的，渍水打破了棉花生理代谢的平衡，棉花为适应逆境不断调节代谢过程，通过适时适度地增强或降低抗氧化系统酶活性清除胁迫过程中产生的大量有害的活性氧。内生菌印度梨形孢菌在棉花根部定殖前后也会对棉花生理代谢造成影响，该菌如何定殖到棉花根部以及通过何种途径调节棉花的代谢系统尚有待进一步研究。印度梨形孢菌是一种可以进行离体培养的真菌，可在Kafer和PDA等多种合成培养基中生长，得到纯培养物，这为研究该菌与植物互作的分子机制提供了极大的方便。还可以将该菌制成生物菌肥、生物保护剂或生物调节剂应用于大田生产，对于农林业中防治涝渍灾害、干旱逆境和诱导植物抗病性具有重要意义。

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