鸡源大肠杆菌的耐药性监测与分析

张玉果,冯海光

(1.邯郸市神康药业有限公司,河北邯郸056011；2.河南省鹤壁市山城区畜牧局，河南鹤壁458000）

鸡大肠杆菌病是由埃希氏大肠杆菌(E.coli)的某些致病性菌株所引起的多种疾病的总称，也是对养鸡业危害严重及常见的一种细菌性疾病，临床症状和病理变化多变,且多与病毒性疾病和其他细菌性疾病并发,给养鸡业造成了严重的经济损失。随着我国畜牧业的发展,盲目大量滥用抗生素现象普遍发生。有的养鸡场从购入雏鸡开始就不断喂服抗菌药物,直至出栏上市为止,还有的养鸡场在饲料中不合理地混合添加抗菌药物,免疫注射时也给予大量的抗菌药物,导致大肠杆菌的耐药菌株不断出现,耐药谱不断扩大,一旦发病,很多药物都难以奏效;同时也加剧了抗菌药物在畜禽体内的残留,给我国畜牧业的持续发展和人类的身体健康带来潜在危害。这就需要对鸡源大肠杆菌进行药敏试验，以便准确有效地筛选出高敏药物进行治疗。

近年来，埃希氏大肠杆菌的耐药性呈上升趋势。20世纪50年代禽致病性埃希氏大肠杆菌几乎没有耐药性产生，而60年代的分离株对链霉素、四环素产生了耐药性，20世纪70年代对氨苄西林、氯霉素、磺胺甲基异恶唑等产生了耐药性，80年代至90年代初对阿莫西林、庆大霉素、卡那霉素、萘啶酸、头孢塞吩等产生了耐药性。随着时间的推移,埃希氏大肠杆菌的耐药率大幅度上升,多重耐药菌株剧增,耐药谱增宽,临床上分离的埃希氏大肠杆菌对环丙沙星的耐药性已居耐药性的首位。据报道，微生物对大多数喹诺酮类药物的耐药率达10%以上，而在欧美等发达国家,埃希氏大肠杆菌对喹诺酮类药物均很敏感,耐药率一般只有5%左右；在我国部分地区埃希氏大肠杆菌对大多数喹诺酮类药物的耐药率却高达40%以上。产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的埃希氏大肠杆菌现已分布全球各个角落,它们的流行呈增长趋势,也导致埃希氏大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性遍及全世界。

大肠杆菌抗原性复杂、血清型多样，特别是在规模化养鸡业的迅速发展下，鸡源大肠杆菌新的血清型又在不断出现，且其不同的菌株对同一种抗菌药物的敏感性也不相同，使得抗菌药物的防治效果越来越差，兽医工作者不能很好地掌握药物对其的敏感程度。因此，对鸡源大肠杆菌的耐药性进行监测与分析,对于指导临床合理用药及控制本病的流行非常重要。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 培养基：普通营养琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基，北京双旋微生物培养基制品厂生产。

1.1.2 药敏试纸片：由鹤壁市山城区动物疫病预防控制中心提供。

1.1.3 菌株：由鹤壁市动物疫病预防控制中心提供（20株）。

1.1.4 器材：恒温培养箱、培养皿、接种环、酒精灯、显微镜、移液器、滴头、镊子、标签、记号笔、直尺。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基的制备

称取普通营养琼脂45克、麦康凯琼脂23克，分别置于两个洁净三角烧瓶中,然后各加入灭菌蒸馏水1000毫升、500毫升，加热煮沸溶解后放入高压蒸汽锅内121℃灭菌20分钟；当琼脂温度降到55℃时，在超净工作台上分别均匀地倒入灭菌的平皿内,每个灭菌的平皿倒入15毫升，待凝固后置37℃恒温箱中培养18小时；放入4℃冰箱保存备用。

1.2.2 菌株的培养

用接种环钓取少许菌株，常规划线接种于普通营养琼脂培养基上,进行纯培养。而后钓取纯培养的菌落接种于麦康凯琼脂培养基上,37℃培养24小时,见生长出砖红色菌落;再挑取纯培养的菌落涂片、革兰氏染色、镜检，呈单个散在或成对的革兰氏阴性红色小杆菌。根据上述细菌培养特性和染色镜检，可初步验证为大肠杆菌,纯培养菌落备用。

1.2.3 试验操作方法——药敏片法

药敏试验：按WHO推荐的药敏片法进行。本法是根据抑菌环直径大小来判定细菌对抗菌药物的高敏、中敏、耐药的方法。该方法的优点是操作简单、易于掌握;缺点是费时，只能进行半定量测定。

用接种环钓取l环纯培养的大肠杆菌，置于1毫升灭菌生理盐水中，充分混匀后用灭菌吸管吸取此液，均匀的布满于普通营养琼脂培养基的整个表面；待营养琼脂表面稍作干燥后，用灭菌镊子取各种药敏纸片均匀贴到营养琼脂表面,(为保证药敏纸片与营养琼脂培养基表面完全接触，各个药敏纸片都应用灭菌镊子轻压一下）每个平板放6张药敏试纸片，37℃培养24小时；观察结果，用直尺测定抑菌圈的直径。整个操作过程都应注意无菌操作，避免杂菌污染。

1.2.4 判定标准

按抑菌圈的直径大小作为敏感性高低的判断标准。抑菌圈大表明细菌对该药物的敏感性高，耐药性低；反之，则表明细菌对该药物的敏感性低，耐药性高。药敏纸片的种类及判定标准见表1。

表1 药敏纸片的种类及判定标准

2 试验结果与分析

2.1 20株鸡源大肠杆菌菌株来源情况见表2

表2 20株鸡源大肠杆菌菌株的来源情况

2.2 20株鸡源大肠杆菌对12种药物的耐药情况见表3

由表3可以看出，20株鸡源大肠杆菌对12种抗菌药物都有不同程度的耐药性。青霉素、四环素对其完全没有作用，全部耐药；红霉素、利福平对其作用也很小，没有对其产生高敏；而阿米卡星、头孢曲松和头孢唑啉的敏感性较高。具体统计结果见表4。

表3 20株鸡源大肠杆菌对12种药物耐药情况

由表4可以看出：对鸡源大肠杆菌产生严重耐药性的药物依次是青霉素、四环素、林可霉素、环丙沙星、红霉素、蒽诺沙星，这6种药物的耐药率都大于50%，耐药最为严重的是青霉素，达到了100%；对大肠杆菌中度敏感的药物依次是：头孢唑啉、诺氟沙星、卡那霉素，中敏率分别是60%、55%、50%；高敏的药物分别是：氟苯尼考、头孢曲松、阿米卡星，高敏率分别是70%、65%、60%。

2.3 不同地区分离菌株耐药性比较见表5

由表5中可以看出，不同地区鸡源大肠杆菌的耐药情况不同，敏感药物也不一样，因此应根据各地的实际情况合理用药。

3 讨论

从试验结果看，大多数鸡场的大肠杆菌存在着广泛的耐药性，这给药物治疗带来了很大的难度，造成这种局面与下列因素有关：养殖户用药过程中选药、剂量、疗程不当；存在严重滥用药物现象，常常在未确定病因的情况下，大量使用各种各样的抗菌药；目前兽药市场相当混乱，同一有效成分命名五花八门，误导了专业户；假冒伪劣兽药产品充斥市场，个别兽药厂家产品的有效成分含量不足，标记的剂量、疗程常不能达到治疗效果。

3.1 大肠杆菌耐药性产生的机制

表4 药敏试验结果统计

表5 不同地区分离菌株耐药性比较

3.1.1 一是先天性获得，主要是由于其细胞壁的结构特点决定，先天性获得耐药性的变化一般不大。

3.1.2 二是后天性获得，主要是由于耐药性质粒的产生，如：R质粒。R质粒的主要特征：一是能通过细菌与细菌间的接触，由耐药菌株转移到敏感菌株，从而使原来的敏感菌株获得耐药性；另一特征是有自我复制的功能，在细胞分裂时，R质粒也同时进行复制从而使子细胞也带有耐药质粒。R质粒的耐药机制有：质粒基因编码产生各种钝化酶分解抗生素；耐药性质粒控制一些细菌的细胞膜通透性，使抗菌药物不能进入细菌体内，从而使细菌具有耐药性；耐药质粒的基因编码产生一些特殊的酶，阻止抗生素与细胞内靶子结合而产生抗药性。R质粒的传播是细菌产生耐药性的重要原因之一，特别是在规模化养殖条件下，R质粒更易在细菌之间传播，造成耐药菌株的广泛产生。

3.2 解决其耐药性的对策

3.2.1 合理用药、谨慎用药和正确使用抗菌药物

在临床选用抗菌药物治疗鸡大肠杆菌病时，要考虑本场的用药习惯，选择少用或未曾用过的药物，避免单一和长期重复使用同一种抗菌药物。一旦选定了正确的抗生素，下一步就要确定准确的药物剂量、频率和疗程。最好在分离病原菌的基础上先做药敏试验，选用高敏药物，这样才能达到理想的治疗效果。

另外，在选择高敏药物进行治疗时，还要考虑这些高敏药物的吸收途径，因为我们所做的药敏试验是药液直接和细菌接触，而在给鸡用药时，必须通过机体的吸收才能使药物达到一定的效果，所以在给鸡用药时，高敏药物一定要配合适宜的给药途径，这样才能达到最好的治疗效果。

3.2.2 联合用药

主要是利用抗菌增效剂与某些药物的协同作用。通过联合用药可以扩大抗菌谱，增强疗效、减小药物用量、降低或避免毒副作用，进而减少或延缓耐药菌株的产生。

3.2.3 应用中草药治疗

许多中草药具有抑制和杀灭细菌作用，清热解毒类中药也广泛用于防治感染类疾病，并具有较好疗效和较低毒副残留及抗药性等优点。

3.2.4 应用微生态制剂治疗

微生态制剂可以促进鸡体内正常微生物菌群的建立，使得正常菌群占据整个消化道，而后进入的致病菌就难以在消化道壁上找到附着点，从而竞争性地抑制了致病性大肠杆菌的生存。

4 小结

4.1 对鹤壁市动物疫病预防控制中心提供的20株鸡源大肠杆菌菌株进行药敏试验结果表明：青霉素、四环素、林可霉素、环丙沙星、红霉素、蒽诺沙星严重耐药；头孢唑啉、诺氟沙星、卡那霉素中敏；氟苯尼考、阿米卡星、头孢曲松高敏，因此，临床上应选择上述高敏药物进行治疗。

4.2 近年来，由于人们对抗生素的广泛大量应用，使得一些药物过去有效而现在无效；或者在这个鸡场有效而在另外一个鸡场无效；并且其产生耐药性的速度也比较快。因此，在临床用药过程中我们应当先做药敏试验，筛选出高敏药物，且选择正确的给药途径，将这些高敏药物交替或联合使用，同时大力推广应用中草药和微生态制剂进行治疗，再配合科学的饲养管理和加强环境消毒等措施，以达到最佳的治疗效果，从而减少其耐药机率的发生。