动物microRNA-181的功能与应用前景

常杨,穆伟涛,满朝来

哈尔滨师范大学生命科学与技术学院,黑龙江省分子细胞遗传与遗传育种重点实验室,哈尔滨 150025

动物microRNA(miRNA)是一类长度约17～25个核苷酸、在进化上高度保守的非编码RNA。miRNA在多种细胞活动中通过阻止靶mRNA的翻译或互补结合诱导其降解,在转录后水平调节基因的表达。miRNA 通常结合在靶基因的 3′-非翻译区(3′-UTR)发挥对靶基因的抑制作用,但也发现miRNA能够靶向基因的编码区(Coding sequence,CDS),如Huang等[1]研究表明miR-181a就是通过直接靶向锌指蛋白mRNA的编码序列来抑制其表达,进而实现转录后调控。miR-181以其在多种组织脏器中选择性表达(如小鼠miR-181在胸腺、脑和肺等组织脏器中选择性的高表达[2]),并具有功能多样、生物学效应显著等特点,近年来逐渐成为人们关注的焦点之一。

人和小鼠miR-181家族都包括4类高度保守的成员,即 miR-181a、miR-181b、miR-181c和 miR-181d,至今已鉴定出它们的种子区域能够靶向上百种mRNA。miR-181对于细胞的生长分化和机体的免疫功能调节至关重要,并且在多种疾病中发现了miR-181表达异常。本文从细胞增殖、凋亡、分化、免疫和肿瘤等几个方面综述了动物miR-181的研究进展,以期为miR-181的深入研究提供参考。

1 miR-181与细胞增殖和凋亡

细胞的增殖与凋亡是动物机体正常生长代谢的必然过程,该过程被众多细胞信号分子以精确机制网络调控。其中,miRNA作为转录后调控的主要表观调控机制之一,miR-181家族成员参与多种细胞的增殖和凋亡过程,在细胞的生长代谢中发挥关键的调控作用(表1)。

首先,miR-181能够抑制多种细胞的增殖过程。例如,Zhang等[3]研究发现ActivinA能以剂量和时间依赖性方式抑制miR-181a在小鼠颗粒细胞(Granulosa cell)中的表达; 如果 miR-181a过表达,则会抑制其靶标 ActivinⅡA 型受体(ActRⅡA)的翻译,进而导致细胞周期蛋白 D2(CyclinD2)和增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达的下调,从而阻止该细胞的增殖,所以miR-181a在功能上能够负向调控颗粒细胞的增殖。Liu等[4]研究发现miR-181a也可以抑制间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)的增殖,却不影响该细胞的凋亡; 在MSC细胞中过表达miR-181a,能够阻止TGF-β信号路径的激活,并且下调该路径中的靶基因Tgfbr1(Transforming growth factor beta receptor 1)和Tgfbrap1(Transforming growth factor beta receptor associated protein 1)表达活性,进而实现 miR-181a抑制MSC细胞增殖的调控作用。此外,Dahlhaus等[5]研究发现,在急性髓系细胞白血病(Acute myelocytic leukemia,AML)细胞中过表达miR-181a会显著降低该细胞的增殖和代谢活性,而抑制miR-181a表达对AML细胞增殖和代谢活性却没有产生影响。所以推测miR-181a调控细胞增殖的途径可能很多,有些细胞效应可能无法用单一信号机制来说明。例如,miRNA的表达变化可能会改变细胞内环境,进而诱导细胞多种功能的改变,综合效果是干扰细胞的增殖过程。

miR-181a除了能够抑制多种细胞增殖外,也可以促进多种细胞凋亡。Zhu等[6]研究发现顺氯氨铂(Cisplatin)处理过的人肾近曲小管上皮细胞(HK-2)凋亡率明显上升,而且miR-181a的表达活性也显著升高,进一步研究表明：miR-181a能够下调抗凋亡蛋白 BCL-2表达活性,上调促凋亡基因Bax,从而促进 HK-2细胞凋亡。Chen等[7]在研究人恶性胶质瘤细胞(U87MG)对放射物质的敏感性时,亦发现在辐射处理后的 U87MG细胞中,BCL-2上调,miR-181a下调; 而过表达miR-181a则会下调BCL-2蛋白。Ouyang等[8]利用荧光素酶检测系统也进一步证明了Bcl-2和Mcl-1是miR-181a的靶标,他们发现在星状胶质细胞中下调 miR-181a能够减少缺糖损伤诱导的细胞凋亡、线粒体功能紊乱和线粒体膜电位消失,所以调控miR-181a的表达对临床提高恶性胶质瘤的治疗效率可能具有重要参考价值。

表1 miR-181在细胞增生、凋亡与分化中的作用

此外,人们发现miR-181b也与细胞增殖和凋亡密切相关,miR-181a和miR-181b虽为同一家族成员,但在相同组织细胞中的生物学作用却大相径庭。例如,Chen等[9]发现在AML细胞中miR-181b是高表达的,miR-181b通过靶向Mlk2基因来促进AML细胞的增殖,所以miR-181b 在AML中起着促进细胞增殖的调控作用,这与miR-181a抑制AML细胞增殖的功能相反。有趣的是,既是同一 miR-181在不同组织细胞中的功能作用也会存在差异。例如 Shi等[10]研究发现人miR-181a和miR-181b在神经胶质瘤细胞中的功能均表现为抑制作用,即抑制肿瘤细胞生长、诱导凋亡和抑制转移,而且miR-181b的抑制效应强于miR-181a,这与miR-181b在AML细胞中的促进作用相反。

2 miR-181与细胞分化

细胞分化在动物机体生长发育和损伤修复中发挥着重要作用,研究发现 miR-181对多种细胞分化具有促进作用(表1)。

首先,miR-181对人胚胎干细胞(Human embryonic stem cells,hESCs)的分化具有促进作用。例如,Xu等[11]研究发现共激活因子相关的精氨酸甲基转移酶1(Coactivator-associated arginine methyltransferase1,CARM1)是miR-181c的靶基因,而CARM1可以催化组蛋白甲基化[12,13],在抑制 hESCs分化中起着积极的作用,所以 miR-181c过表达能够促进hESCs细胞的分化。Kane等[14]发现在hESCs向血管内皮细胞(Endothelial cells,ECs)分化的过程中,miR-181a和 miR-181b以时间依赖性和分化依赖性的方式逐渐增加,在向 ECs细胞分化的hESCs(hESC-ECs)中过表达miR-181a和b能够增加血管内皮细胞特异的标志分子血小板内皮细胞黏附分子-1(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1)和血管内皮钙粘蛋白(Vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)的表达活性,增加NO的产量,促进hESCs向ECs分化。O'Loghlen等[15]发现CBX7(Chromobox protein homolog 7)在ESC细胞分化中发挥着关键作用,并且 miR-181可以通过调控 CBX7进而间接调控ESC细胞的分化。这些研究虽然发现了miR-181以不同的分子机制调控ESC细胞的分化,但研究结果都一致表明miR-181在ESC细胞分化调控中发挥着关键作用。

其次,miR-181对造血干细胞的分化具有促进作用。Mintz等[16]发现在 CD34+造血干细胞中,miR-181a*能够靶向Nanog基因的3′-UTR抑制该基因表达,而NANOG、SOX2和OCT4等是维持细胞自我更新未分化状态的重要因子[17～19],所以miR-181a*能够促进 CD34+细胞的分化。Li等[20]以人 CD34+造血干细胞作为研究模型,发现 Lin28是miR-181a的一个直接靶基因,而且miR-181起着“分子开关”的作用,提高miR-181a表达水平会首先下调Lin28,然后上调let-7,进而促进巨核细胞的分化。

最后,miR-181对成肌细胞和成骨细胞的分化具有促进作用。Naguibneva等[21]发现,在肌纤维分化期间的两个主要阶段里,miR-181是终末分化时上调水平最显著的 miRNA之一,在肌肉肌酸激酶(Muscle creatine kinase,MCK)等分化特异蛋白表达前或表达同时被上调。在小鼠成肌细胞(C2C12)体外分化期间,MyoD诱导Myogenin生成并促进整个分化过程,在缺少miR-181的细胞中 MyoD表达受到抑制。进一步研究发现miR-181能够下调同源盒蛋白HOX-A11(分化过程的一个阻遏物),而HOX-A11会抑制MyoD表达,因此,miR-181表达上调会促进MyoD表达,进而促进C2C12细胞分化。Li等[22]在大鼠成肌细胞(L6)中,利用病毒载体介导 miR-181a表达下调后,发现能够显著促进L6细胞的增生而不发生分化,这也进一步印证了 miR-181对成肌细胞的分化促进作用。在miR-181促进成骨细胞分化方面,Bhushan等[23]研究发现 miR-181a 在 BMP(Bone morphogenetic protein)诱导的 C2C12和 MC3T3细胞成骨分化的过程中显著上调,miR-181a可以通过靶向成骨细胞分化的负向调控子(RGS4 和 GATA6)来抑制TGF-β信号分子,进而促进成骨细胞的分化。

3 miR-181与免疫

miR-181在淋巴细胞的增生分化与发育、自身免疫、炎症、抗病毒及免疫调节等多个方面都具有重要的调控作用(表2)。

首先,miRNA在造血干细胞向各种血细胞分化的过程中扮演着重要的角色。Chen等[2]研究发现miR-181在小鼠骨髓B淋巴细胞中被优先表达,并且miR-181在造血干细胞中的表达也会促进向B细胞系分化,miR-181在促进B淋巴细胞分化方面发挥着重要的调控作用。

表2 miR-181在免疫中的作用

其次,miR-181在T细胞的发育过程中发挥着关键作用。Chen等[24]研究表明 mir-181a-1可以促进CD4-和CD8-T细胞向CD4+和CD8+T细胞的分化,而miR-181c并无此功能。Li等[25]将miR-181a在T细胞中过表达,利用抗原刺激后检测到细胞内钙离子增加,IL-2表达量较对照组也提高了两倍,并且提高了T细胞受体(T cell receptor,TCR)介导的CD4+T细胞的活性,因为在 T细胞发育的整个时期,不同发育阶段的T细胞对抗原的敏感性不同,miR-181a能够下调TCR信号路径的多个负向调节物[26],进而提高TCR对抗原的敏感性,所以miR-181a在T细胞发育期间起到“信号变阻器”的作用。

有趣的是,miR-181c对T细胞的调控却表现出与 miR-181a相反的作用。Xue等[27]研究发现miR-181c的表达在T细胞活化过程中被下调,转染miR-181c模拟物会部分抑制Jurkat 细胞和人外周血单核细胞(Periphera blood mononuclear cell,PBMC)CD4+T细胞的活化,并且降低已激活CD4+T细胞的增殖能力。他们进一步研究发现IL-2是miR-181c的直接靶标,miR-181c能够抑制 IL-2的表达,而IL-2能够促进T细胞的增生,所以miR-181c过表达会抑制外周血CD4+T细胞的活化与增殖。

再次,miR-181能够促进NK细胞(Natural killer cell)的发育,提高NK细胞的功能活性。Frank等[28]研究发现 miR-181的表达水平影响 CD34+造血干细胞向NK细胞的分化和IFN-γ在初级CD56+NK细胞中的表达量。当敲除miR-181a或miR-181b,会导致成熟的CD56+NK细胞比例降低,而过表达miR-181a或miR-181b会导致CD56+NK细胞明显增多,同时显著提高 NK细胞的 IFN-γ产量。进一步研究发现负向调节 Norch信号的 NLK(Nemo-like kinase)是miR-181的直接靶标,而活化的Norch信号通路能够促进 NK细胞的发育,所以 miR-181是通过下调NLK这一机制来促进NK细胞的发育。此外,Ziętara等[29]和 Henao-Mejia等[30]的研究都一致表明miR-181是早期NKT细胞发育生物合成代谢所必需的,miR-181可以调控磷酸酶 PTEN的表达来控制PI3K信号通路,而该信号通路是免疫细胞合成代谢的主要激活途径。

另外,miR-181与自身免疫反应也具有密切关系。Lashine等[31]研究发现miR-181a在系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)患者中表现为显著下调,而 PCAF(p300-CBP-associated factor)的表达量却显著上调,这是因为PCAF是miR-181a的靶标,又是p53调控相关的关键蛋白,PCAF可以通过乙酰化 p53使其稳定,并泛素化 p53的负向调控子HDM2,使更多的p53释放出来促进细胞凋亡。细胞凋亡紊乱与自身免疫病的发生密切相关,虽然目前通过改变 miRNA的表达活性实现对相应疾病的治疗仍有待于深入研究,但miR-181在SLE中的调控机制给自身免疫病的治疗提供了一个新的探索思路。

最后,miR-181在炎症反应中也扮演着重要角色,既能表现出抑制炎症的功能,也能发挥对炎症反应的促进作用。Wu等[32]报道了miR-181a负向调节氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein,Ox-LDL)诱导树突状细胞(Dendritic cells,DCs)的炎症反应。他们在DCs细胞中过表达miR-181a,会诱导下调CD83和CD40,减少Ox-LDL刺激下的CD83和 CD40的上调,还可以抑制炎症因子 TNF-α和IL-6的表达,并提高抗炎因子IL-10的表达; 而抑制内源 miR-181a的表达,则会增加 Ox-LDL诱导的CD83和 CD40的表达。进一步研究发现 miR-181a是通过靶向下调关键的炎症相关转录因子 c-Fos的表达,进而实现炎症抑制效应。Hutchison等[33]也进一步验证了miR-181的抗炎作用,发现 miR-181家族成员在星状胶质细胞中是受发育调控和高表达的,封闭 miR-181的表达会增强 LPS(Lipopolysac-charides)诱导的星状胶质细胞促炎因子(TNF-a、IL-6、IL-1b、IL-8)和 HMGB1(High mobility group box-1 protein)的生成,而过表达 miR-181则会导致抗炎因子 IL-10表达的显著上调。进一步研究发现甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)和X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)mRNA是miR-181的作用靶标,所以miR-181在星状胶质细胞炎症的分子反应中发挥重要的抗炎作用。而Feng等[34]发现miR-181在哮喘小鼠模型中却发挥着促进炎症反应的作用,研究结果表明,在哮喘病发作的前期,哮喘组小鼠脾 CD4+T 细胞miR-181a的表达水平比对照组显著提高,5 d后降至与对照组相同的水平,并且miR-181a表达量与炎性细胞的数量呈正向线性相关。

值得一提的是,miR-181能够靶向病毒复制所需的胞内因子或者直接靶向病毒基因组 RNA来抑制病毒的复制,进而参与宿主的抗病毒免疫应答。Guo等[35]研究发现miR-181家族成员能特异结合在猪繁殖和呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)基因组的ORF4基因下游的一个高度保守区上,以特异性和剂量依赖性方式直接抑制 PRRSV的复制,其中以 miR-181c表现出最强的抑制效应。Gao等[36]研究发现miR-181能够靶向细胞CD163 mRNA的3'-UTR,下调猪血单核细胞和肺巨噬细胞(Pulmonary alveolar macrophages,PAMs)中PRRSV受体CD163的表达,CD163下调后会抑制PRRSV进入PAMs的感染效率,所以miR-181c可以被用于抗 PRRSV感染的治疗靶标,在抗PRRSV感染方面具有潜在的应用价值。

4 miR-181与肿瘤

蛋白编码基因(如癌基因和抑癌基因)在揭示肿瘤发生和发展中起着关键作用,而近来越来越多的证据表明：miRNA的功能失调也与肿瘤发生密切相关。Ji等[37,38]研究发现 miR-181能够直接靶向肝细胞分化转录调控子(如尾型同源盒转录因子 2(Caudal type homeobox transcription factor 2,CDX2)和GATA结合蛋白6(GATA6))和Wnt/β-catenin 信号通路抑制子(NLK))。进一步研究发现,miR-181家族成员的表达与 β-catenin表达成正相关,而且 miR-181a-2和 miR-181b-2基因启动子区域存在 7个β-catenin/Tcf4结合位点,表明 miR-181可以被原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)中 Wnt/βcatenin信号路径激活,这说明 miR-181、NLK 和β-catenin存在相互调控关系,为将来治疗HCC提供了一个有效的切入点。此外,Meng等[39]研究发现在肝癌干细胞(Hepatocellular cancer stem cells,HSCs)中let-7 和miR-181家族成员的表达上调。抑制let-7能够上调HSCs对 sorafenib 和 doxorubicin的化疗敏感性,沉默miR-181的表达会导致HSCs迁移和侵袭能力降低; 如果敲除 HSCs细胞的 IL-6和 Twist基因会显著降低let-7 和miR-181的表达,并会抑制化疗抗性和细胞侵袭。他们还发现 let-7直接靶向SOCS-1和caspase-3,而miR-181直接靶向RASSF1A、TIMP3 和 nemo-like kinase(NLK),这进一步表明let-7和miR-181可能会成为治疗肝癌的分子靶标。

在肝癌的发生方面,Song等[40]研究发现当肝癌细胞(HepG2)暴露于多环芳烃(PAHs)的苯并(a)蒽(Benzo[a]anthracene,BA)和苯并(k)荧蒽(Benzo[k]fluoranthene,BF)下,miR-181a、-181b 和-181d 的表达会显著上调,miR-181的有效靶标MAPK磷酸酶-5(MAPK phosphatase-5,MKP-5)被显著抑制,而此时 p38 MAPK的磷酸化水平却迅速提高。封闭miR-181表达后能够增强MKP-5的表达和抑制p38 MAPK的磷酸化,并且能够抑制癌细胞的迁移,表明 miR-181是通过靶向 MKP-5进而来调控 p38 MAPK活性,并在PAH诱导的肝癌发生中起着关键作用。Wang等[41]利用饲喂缺乏胆碱和氨基酸食物(Choline-deficient and amino acid defined,CDAA)的小鼠培育65周龄的癌前病变和84周龄的肝癌模型,结果表明饲喂 CDAA食物的小鼠在早期阶段miR-181b上调,miR-181b通过靶向下调金属蛋白酶3(Tissue inhibitor of metalloprotease-3,TIMP3)进而促进肝癌发生。这些研究数据表明：miR-181不但是肝癌发生的诱因,也可能成为肝癌治疗的有力武器。

不同miR-181家族成员生物学功能的差异在肿瘤疾病中也得到了有力体现。例如,miR-181a能够促进胃癌的发生发展,而miR-181b却能够抑制胃癌细胞的增生。Zhang等[42]研究发现miR-181a在人胃癌组织中过表达,并且miR-181a过表达会促进癌细胞的增殖、转移和入侵,抑制胃癌细胞的凋亡。进一步研究发现 miR-181a是阻止了抑癌基因Klf6(Kruppel-like factor 6)的表达,进而对胃癌实现正向调控。而Chen等[43]发现miR-181b在人胃腺癌组织中显著下调,这是因为miR-181b能够下调cAMP反应元件结合蛋白(CREB1)的表达,所以miR-181b过表达会阻抑胃癌细胞的增殖。

近年来,循环miRNA在疾病诊断中的地位越来越受到人们的关注,其中 miR-181在乳腺癌的发生和早期筛检中也表现出了潜在的应用价值。例如,Neel等[44]研究发现在乳腺癌细胞中,miR-181被activin 和 TGF-β共同调控,并在这两个生长因子的下游发挥着肿瘤促进作用。Guo等[45]采用实时定量 PCR技术检测,发现乳腺癌患者血清中的 miR-181a水平显著低于正常人,他们利用miR-181a作为标记物用于乳腺癌的诊断,诊断结果的敏感性和特异性分别为70.7%和59.9%,这显著高于传统的肿瘤标记物 CA153和 CEA(敏感性分别为 10.53%和9.21%),所以血清 miR-181作为一个肿瘤标记物,在早期乳腺癌诊断和治疗靶标的选择中可能具有较好的应用前景。

miR-181不但在肿瘤诊断中具有潜在的应用价值,而且在肿瘤的预后中也具有积极的开发前景。Nishimura等[46]利用实时定量 PCR技术分析了 162例结肠癌(Colorectal cancer,CRC)病人,发现正常结肠组织与结肠癌组织中 miR-181a的表达并无显著差异; 但是,根据 miR-181a的表达水平,把癌组织样本分为低水平表达和高水平表达两组,通过对这两组的临床病理因子和预后的比较,发现 miR-181a高水平表达组比低水平表达组有着显著的预后不良(P=0.011)。多变量分析表明miR-181a高表达对CRC而言是一个独立的重要预后因子,但是miR-181a表达与临床病理参数间没有观察到相关性。Pichler 等[47]的研究结果也表明miR-181a的表达水平与CRC病人的低存活率相关,表明 miR-181a也可能会成为CRC病人预后诊断中一个新的预后因子。在其他疾病方面,Lin等[48]在血液恶性肿瘤中发现miR-181a/b的表达水平与总存活率(Overall survival,OS)显著相关,miR-181a/b高表达组较比低表达水平组能够延长血液肿瘤病人的OS,这表明miR-181也可能成为血液肿瘤疾病的一个重要预后因子。

总之,越来越多的数据表明 miR-181家族成员在参与肿瘤发生、转移、诊断和预后等方面都发挥着重要作用(表3),其中以miR-181a和b生物学功能表现最为活跃,相信随着研究的深入,miR-181在肿瘤中的更多功能和作用机制会被逐渐发现,并且miR-181在肿瘤疾病的诊断和治疗中应用价值能够逐渐得以实现。

表3 miR-181在肿瘤中的作用

5 展 望

miR-181家族成员在细胞增生、分化与凋亡、免疫和炎症反应、肿瘤发生和治疗等诸多领域都具有重要的调控作用,虽然目前关于 miR-181的研究还大多停留在实验室阶段,但是 miR-181在医学和畜牧业上已经初步展露出其潜在的应用价值。例如,测定血清 miR-181a水平能够提高乳腺癌早期诊断的准确性[45],miR-181c具有抗猪PRRSV感染和繁殖方面的能力[35,36],miR-181a的调控作用对于治疗SLE具有意义[31,32],以及miR-181a对结肠癌患者具有预后价值[46]等等,这些研究都表明：miR-181无论作为肿瘤的分子标记物用于疾病的诊断和预后,还是作为药物作用的靶标用于畜牧业上的抗病毒治疗,都具有巨大的潜在开发前景。

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