复杂疾病的遗传易感基因区域的精细定位

宋庆峰,张红星,马亦龙,周钢桥

1.广西医科大学附属肿瘤医院介入治疗科,南宁 530021;2.军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京蛋白质组学研究中心,蛋白质组学国家重点实验室,北京 102206;3.蛋白质药物国家工程研究中心,北京 102206;4.国家蛋白质科学中心(北京),北京 102206

截止到2012年4月,以单核苷酸多态性(Singlenucleotide polymorphism,SNP)为遗传标记,采用全基因组关联研究(Genome wide association studies,GWAS)的策略已在 666种疾病(或性状)中发现了3869个显著关联(P<5.0×10–8)的遗传易感基因区域[1]。但是,在这些区域内,与复杂疾病最显著关联的遗传变异或致病性遗传变异都有待进一步确认,其生物学功能也尚待深入阐明。当遗传易感基因区域内的 SNP位点之间存在较强的连锁不平衡(Linkage disequilibrium,LD)以及存在遗传因素和环境因素交互作用时,上述工作变得更加具有挑战性。后GWAS时代的主要任务之一是对复杂疾病易感区域内的致病性遗传变异进行精细定位(Fine mapping),即在通过GWAS鉴定到的疾病易感区域内获取高密度的遗传变异目录及其基因型,从中鉴定出易感区域内最显著关联或致病性的遗传变异,并阐明其生物学功能[2]。目前,已出现一些系统性的策略用于复杂疾病的精细定位研究(表1)。

1 针对常见遗传变异(Common variant)的精细定位研究

1.1 确定最显著关联的SNP位点

SNP是可遗传的变异中最常见的一种变异形式,在群体中其次要等位频率(Minor allele frequency,MAF)大于1%。目前,GWAS采用的商业化SNP分型芯片已经可以同时检测100万个甚至更多的SNP位点。但是,这些芯片仍远未能覆盖人类基因组中的全部 SNP位点,一些与复杂性状最显著关联的SNP位点可能会被遗漏。因此,获得易感基因区域内高密度的SNP目录是进行精细定位的前提之一。可以通过以下两种方法增加易感基因区域内的 SNP密度,然后再进行遗传关联分析,以确定最显著关联的SNP位点。

1.1.1 根据参考数据集进行SNP的推断(Imputation)

由许多国家共同参与的“人类基因组单体型图计划”(HapMap计划)和“千人基因组计划”(1000 genome project)为人们提供了比较全面的人类基因组DNA序列变异数据。以这些研究计划产生的SNP数据为参考集,可以通过计算推断出与已分型 SNP位点相邻的未分型SNP位点的基因型,从而大大降低遗漏的可能性[3]。用于推断的代表性软件有MACH[4]和IMPUTE[4]等,现已得到广泛应用。例如,Raychaudhuri等[5]以2767个个体的全基因组数据为参考集,对6个独立的类风湿性关节炎的GWAS数据集进行推断,并对推断结果进行了遗传关联分析,结果在 MHC区域发现了 5个新的与疾病显著关联的 SNP 位点(P<1.0 ×10–550)。Peters等[6]在 20488 个非洲裔美国人中,对体重指数(Body mass index,BMI)的候选易感基因区域——FTO基因所在的基因组区域(646 kb)进行推断和关联分析,结果鉴定出一个新的与体重指数显著关联的SNP位点rs56137030(P= 8.3 × 10-6)。Liu 等[7]在来自英国的 2861 例原发性胆汁性肝硬化患者(Primary biliary cirrhosis,PBC)和 8514例对照中,对约 20万个多态性位点进行分型、推断和关联分析,结果新发现了3个与PBC显著关联的SNP位点(P<5.0 ×10–8)。以往在日本人群中开展的 GWAS研究发现,MICA基因上的rs2596542与丙型肝炎(Hepatitis C virus,HCV)相关的肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)显著关联。Lange等[8]进一步在瑞士人群中对此区域进行了分型和推断,关联分析结果表明,MICA基因上游HCP5基因上的rs2244546是一个新的疾病易感性标志物。

SNP的推断基于单体型结构和单体型内各SNP位点之间的LD程度,参考集的样本量越大,推测的成功率和准确率就越高。但是在现阶段,各项研究所能提供的参考集的样本量均较小。另外,有些SNP位点在人群中等位频率较低(MAF <2%),且与邻近的已被芯片检测到的 SNP位点并不存在较强的LD(r2<0.8),从而无法被成功推断出来[9]。因此,用推断这种方法无法彻底解决最显著关联的SNP被遗漏的情况。

1.1.2 对目标区域进行重测序(Target region resequencing)

对GWAS鉴定的易感基因区域进行重测序,将有助于全面了解一个区域内所有的遗传变异信息,并发现与复杂性状最显著关联的 SNP位点。此外,还可以发现一些新的功能性罕见变异(Rare variation)[10]或结构变异,如拷贝数变异(Copy number variation,CNV)[11]和小的插入-缺失变异(Indel)等[12],从而鉴定到易感基因区域内与复杂性状最显著关联的或致病性的其他各类遗传变异形式。近年来,高通量的二代测序技术得以迅速发展,大大降低了测序的费用及缩短了测序的时间,使得在大量样本中进行目标区域的重测序成为现实。例如,Xiang等[13]对已知的高原低氧适应基因EGLN1所在的基因组区域(长约 59.4 kb)进行重测序,新发现一个非同义突变(rs186996510,D4E)的频率在高原藏族人群和低海拔汉族人群中存在显著差异(Fst= 0.709),提示rs186996510可能是高原低氧适应的成因性SNP。在对镰刀状红细胞贫血的易感基因重测序研究中,除了发现新的显著关联的常见变异位点外,还在MYB基因上发现了 3个新的与疾病显著关联(P=5.0×10–3)的罕见遗传变异[14]。

1.2 通过SNP位点筛选候选易感基因

确定了与复杂疾病等性状最显著关联的遗传变异后,还要阐明其生物学功能。通过GWAS鉴定到的最显著关联的SNP位点大多位于内含子、基因间区等非编码区域内,这对于直接阐明易感SNP位点的生物学功能造成了一定的困难。研究显示,这些SNP位点主要通过改变相关基因的转录表达水平或者转录本的剪接等方式影响疾病的发生风险[15]。

1.2.1 通过调控元件分析寻找功能性的SNP位点和易感基因

启动子、沉默子和绝缘子等基因表达调控元件,能够通过正调控[16]或负调控[17]的机制来调节相关基因的表达量。而组蛋白、非编码RNA等表观调控元件,能够通过末端修饰[18]、自身活性的改变[19]或量的改变[20]等机制来调节相关基因的表达量。因此,位于各类调控元件序列中的与疾病易感性显著关联的遗传变异,有可能通过自身等位型的变化影响这些调控元件的调控机制而影响相关基因的表达水平,从而影响疾病发生的风险[21]。例如,Pomerantz等[22]研究发现,结直肠癌的易感基因区域8q24中最显著关联的SNP位点是rs6983267,该SNP位于MYC基因的增强子序列内,其风险等位型能够增加MYC基因的增强子与转录因子TCF7L2的结合,导致MYC基因的表达量增加,从而增加结直肠癌的发生风险。Peters等[6]在FTO基因所在基因组区域发现了一个新的与体重指数显著关联的SNP位点rs56137030(P= 8.3 × 10-6),并进一步发现有多个与之呈强LD的 SNP位点处于调控元件之中,其中 rs1421085在转录因子CUX1的结合上具有等位特异性。也有研究发现,某些遗传变异可以影响基因网络内不同中枢节点之间的联络,进而影响下游基因的表达量,最终影响疾病的发病风险[23]。

表1 精细定位的研究策略

1.2.2 通过eQTL分析寻找功能性的SNP位点和易感基因

在人类基因组上,能够影响基因的mRNA或蛋白表达水平的遗传变异位点称为表达数量性状位点(Expression quantitative trait locus,eQTL),检测遗传变异与mRNA或蛋白质表达量之间是否有关联的统计分析,称为eQTL分析[24]。对GWAS鉴定到的易感基因区域内的SNP位点进行eQTL分析,有可能发现直接影响相关基因表达、进而改变疾病发生风险的功能性SNP位点。按照功能性SNP位点与受其调控的基因之间的距离,可以分为顺式(cis-eQTL,1 Mb范围内)和反式(trans-eQTL,1 Mb范围之外)调控两种类型[25]。在以往的研究中,eQTL分析大多是在淋巴细胞系中进行,例如 Morley等[26]在 14个大家系的永生化B细胞中发现,近1000个SNPs能够作为顺式或者反式eQTL位点调节3554个基因的表达量。但是,在复杂疾病的研究中,eQTL分析更应该在与疾病对应的特定组织中进行[27]。例如,在肝脏组织中,对高脂血症的易感基因区域 1p13开展的eQTL分析显示,最显著关联的SNP位点(rs12740374,P< 1.0 × 10–40)的风险等位型能增强SORT1基因启动子与转录因子 C/EBP的结合,从而增加该基因在肝脏中的表达,使肝脏中极低密度脂蛋白(Very low-density lipoprotein,VLDL)的分泌增加,进而增加血清中低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein cholesterol,LDL)和 VLDL的浓度,最终增加高脂血症的发生风险[28]。

1.3 通过确定显著关联的单体型和跨种族的单体型对比来确定候选易感基因

单体型是指在后代个体中没有发生重组的祖先染色体片段。由于构成单体型的SNP位点都位于同一条染色体上的某一区域内,且各位点之间具有一定程度的LD,所以有时难以通过独立性检验判定哪个 SNP位点与疾病更具有关联性。在这种情况下,这些SNP位点可能以单体型的形式与疾病相关联[2]。例如,Galameau等[14]在对镰刀状红细胞贫血的研究中,发现rs7599488和rs10189857(r2= 0.96)与血红蛋白浓度之间存在显著关联; 进一步的单体型分析发现,与既往研究中所发现的关联位点rs4671393(P=3.7 × 10–37)相比,rs7599488、rs10189857 和 rs4671393构成的单体型具有更加显著的关联程度((P= 4.0×10–45),从而提示这3个SNP位点通过单体型的形式共同在镰刀状红细胞贫血的易感性上发挥作用。

在确定了单体型与疾病的相关性后,如何确定候选易感基因是极其关键的一步。对于一些长度较短、只包含有一个基因的单体型而言,可直接将该基因确定为候选易感基因。对于长度较长、包含有多个基因的单体型而言,可以尝试在不同种族人群之间比较SNP位点之间LD程度的差异来定位候选易感基因。

HapMap计划和千人基因组计划的单体型数据显示,同一基因组区域内的单体型结构在不同种族之间具有差异性。非洲人的单体型比其他种族的单体型更短,原因在于非洲人有更长的历史,从而有更多的重组来打破原有单体型的结构,从而形成新的单体型。同时,大量 GWAS显示,同种疾病在不同种族之间具有共同的易感区域[29]。例如,针对发作性睡病(Narcolepsy)的GWAS显示,19q13.2区域是高加索人、亚洲人和非洲裔美国人 3个不同种族共同的易感基因区域[30]。6q23区域是高加索人和亚洲人共有的系统性红斑狼疮的易感基因区域,进一步对比两个种族中该区域的风险单体型结构,发现其中有连续6个SNP位点的基因型完全一致。因此,推测这6个位点所构成的单体型可能为两种人群共有的风险单体型,据此可将易感基因区域缩小至 48.5 kb,并确定了TNFAIP3是系统性红斑狼疮的候选易感基因[31]。最近,Wu等[32]通过在不同种族人群中对血脂水平的候选易感基因进行精细定位分析,成功地将GCKR、PPP1R3B、ABO、LCAT和ABCA1等易感基因的致病性位点进一步缩小了范围,例如发现GCKR基因中的功能性变异 rs1260326(P446L)可能是甘油三脂水平的成因性 SNP。因此,在不同种族中比较同一易感基因区域的单体型结构,有利于缩小易感区域的范围和最终确定候选易感基因。

2 针对罕见遗传变异(Rare variant)的精细定位研究

GWAS常常是基于“常见疾病-常见变异”的假说而开展的。但是基于“常见疾病-罕见变异”假说开展的研究显示,基因编码区内新近发生的罕见遗传变异(MAF<1%)中富集了较多的有害变异,因此也能影响复杂疾病发生的风险[33]。例如,Dickson等[34]对耳聋 GWAS鉴定到的易感区域进行重测序研究,发现该易感区域内的罕见变异同样可影响疾病的患病风险。Azzopardi等[35]对结直肠腺瘤的易感基因APC进行重测序后发现,在未携带已知常见风险基因型的个体中,基因上多个罕见变异与患病风险具有显著的相关性(P= 1.7 ×10–2)。

由于罕见变异产生的时间较短,在人群中的频率很低,想要有效的发现这些变异需要比发现常见变异更大的样本量和更多的经费[36],这都极大地限制了对罕见变异的研究。例如,在一项对炎症性肠病的70个已知易感基因的重测序研究中,在第一阶段对 112个病例和 112个对照进行重测序后,未发现与疾病发生风险显著关联的罕见变异,于是在第二阶段扩大样本量,对896个病例和1216个对照进行重测序,最终在IL23R基因上发现了p.Arg86Gln、p.Gly149Arg 和 p.Val362Ile与疾病发生风险显著关联的罕见变异[37]。

最近的研究结果显示了罕见变异的一些新规律,包括下文中提及的罕见单体型携带罕见变异、罕见变异在疾病家系中具有较高的频率和多个罕见变异具有累积效应等。针对这些规律制定的研究策略不但有效地提高了检测罕见变异的检验效能,而且减少了需要研究的样本量。

2.1 罕见单体型携带罕见变异

DNA序列中新的罕见变异可以与常见变异一起构成新的单体型,这些单体型由于产生的时间较短,没有足够的时间传播,所以在人群中的频率小于1%。对与疾病相关联的由常见变异构成的罕见单体型进行重测序,有可能在这些罕见单体型上发现致病的功能性罕见变异[38]。例如,Raychaudhuri等[39]对老年性黄斑变性GWAS鉴定的易感区域进行深入研究,发现在对照组中频率为 0.048%的 H5单体型(CFH基因)能增加疾病的患病风险。对该易感区域内携带不同结构单体型的 84个个体进行重测序后发现,携带H5单体型的6个个体在CFH基因的22号外显子上均有一个能够直接改变氨基酸的罕见变异R1210C(在人群中的频率小于0.1%),而在其他携带非H5单体型的个体中均未发现该变异。通过上述研究策略,Raychaudhuri等成功地从罕见单体型上发现了一个与疾病易感性显著关联的罕见变异(P=9.4 × 10–3)。

2.2 罕见变异在疾病家系中具有较高的频率

在家系中,各成员来源于共同的祖先,其中某一患者携带的致病变异可能会传递给下一代子女,并导致他们患病。因此,在普通人群中频率较低的致病性罕见变异,在家系患病个体中会具有较高的频率,从而更容易被发现并了解其遗传模式。例如,Ewing等[40]在对前列腺癌易感区域17q21-22的研究中,发现与前列腺癌发生风险相关的 rs138213197在5083个患者中的等位频率为1.4%,在1401个对照个体中的频率为0.1%。但是,在4个前列腺癌的大家系中该变异的频率为 34%,在携带该变异的成员中有 82%的个体患病,大大高于在随机人群中的比例。上述研究结果显示,基于家系的研究策略在精细定位研究中可能更具有优势。

2.3 多个罕见变异具有累积效应

因为罕见遗传变异的发生具有随机性,所以易感区域内与疾病发生风险相关联的罕见变异在不同的患病个体中可能发生在同一易感基因的不同外显子上,对于这些罕见变异,主要通过负荷检验(Burden test)来鉴定其所在的易感基因,同时鉴定它们与疾病发生风险的关联程度[2]。例如,对高脂血症的易感基因ABCA1、APOA1和LCAT进行重测序,对发现的多个位于不同外显子的新的罕见变异进行了负荷检验,显示与疾病发生风险显著关联(P<1.0×10–4)的罕见变异主要富集在ABCA1基因的不同外显子上,这些罕见变异能够直接改变ABCA1基因编码的蛋白质,进而降低血清中高密度脂蛋白的浓度,最终增加高脂血症的发病风险[41]。

3 结 语

以SNP为遗传标记,采用GWAS的研究策略成功地发现了许多复杂疾病及其他性状的易感基因区域。但是,目前也面临着一些巨大挑战,包括缺乏快速、准确和可重复使用的方法用于从这些易感基因区域中精确定位疾病的致病位点或致病基因,以及缺乏简单、流程化的功能研究方案用于阐明致病位点的生物学功能,这将是今后研究工作的瓶颈[2]。因此,应用新的基因组序列检测技术(如高通量测序)和采用更为有效的分析方法,在GWAS鉴定出的易感区域中精确定位与疾病发生风险最显著关联的或致病性的遗传变异,同时采用快速和流程化的功能验证实验来阐明其生物学功能,是后GWAS时代精细定位研究的主要内容之一。

目前,针对常见变异的精细定位研究比较多。这类研究主要通过推断或重测序增加SNP密度,寻找最显著关联的SNP位点,并通过功能元件分析、eQTL分析和单体型分析等方法寻找功能性的 SNP位点和易感基因。随着高通量测序成本的迅速降低,以及基因组功能元件的全面阐释(例如 ENCODE计划)[42],预计今后针对常见变异的精细定位研究将会更多的发现。另一方面,由于未受遗传净化选择的制约和具有潜在的致病性功能[43],罕见变异在遗传易感性中的作用在近年来受到越来越多的关注。今后研究的重要方向之一,将是在通过常见变异鉴定的候选易感基因组区域内寻找致病性的罕见变异和易感基因。进一步对所定位的常见变异或罕见变异进行后续的功能验证,将是精细定位研究的关键所在。只有充分理解了这些变异的生物学意义,才能推动对人类复杂疾病或性状的遗传机制的全面认识。

此外,采用DNA序列的保守性[44]、基因的调控网络[45]和染色质的结构状态[46]等策略对易感区域内的遗传变异进行研究,可以作为上述研究策略的有益补充。另有研究显示,同义突变虽然不改变编码的氨基酸,但是有可能通过三联体核苷酸影响蛋白质的合成速率,从而影响疾病的发生风险[47]。这提示,同义突变也可能是今后精细定位疾病易感基因研究领域的一个全新方向。

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