亚砷酸联合T-VAD方案对老年多发性骨髓瘤患者血清APRIL、β2-m和TPO水平的影响

王欢，陈曦，李静，刘艳春，刘庆荣，陈丽娟

(1.唐山工人医院 血液科，河北 唐山 063001;2.南京医科大学第一附属医院 血液内科，江苏 南京 210029)

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)作为临床较为常见的恶性血液肿瘤疾病之一，其来源于B细胞，以骨髓中浆细胞发生克隆性恶性增殖、积聚以及出现大量单克隆免疫球蛋白或轻链片段为主要特征，老年人由于身体机能较差，是本病的高发人群［1-2］。MM的生长、增殖和凋亡等病理过程受多种因素共同调控，如果治疗不及时，能够引发骨质广泛性损伤、贫血、反复感染、高钙血症以及肾功能不全损害等并发症，严重影响患者的生活质量［3-4］。本文通过观察亚砷酸联合T-VAD方案对老年多发性骨髓瘤患者血清APRIL、β2-m及TPO表达的影响，旨在探讨亚砷酸联合T-VAD方案治疗老年多发性骨髓瘤的价值，从而为临床治疗提供借鉴。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取唐山工人医院血液科2011年1月～2014年1月治疗的88例老年多发性骨髓瘤患者作为观察对象，观察组45例，其中男性24例，女性21例，患者年龄65～80岁，平均年龄(70.96±7.84)岁，其中IgA型共15例，IgG型共18例，IgM型共4例，轻链型共6例(KAP型和LAM型各3例)，不分泌型共2例。根据Blades标准评价疗效将观察组分为有效组32例和无效组15例2个亚组;常规治疗组共43例患者，其中男性22例，女性21例，患者年龄66～81岁，平均年龄(71.25±7.67)岁;其中IgA型共13例，IgG型共17例，IgM型共3例，轻链型共7例(KAP型和LAM型各3例)，不分泌型共3例。另选取同期体检的健康老年人共45例作为对照组，其中男性22例，女性23例，患者年龄66～81岁，平均年龄(71.69±7.75)岁。病例入选标准:①年龄在65岁以上;②观察组患者均符合西医学多发性骨髓瘤诊断标准，明确诊断为多发性骨髓瘤［6］;③健康组排除心、肾、肝、脑血管、肿瘤以及各种炎症疾病，无血液疾病史;④对本实验知情同意，自愿参与。各组性别、年龄等资料无显著性差异。

1.2 实验试剂及仪器 ELISA检测试剂盒(美国ADL公司);pGEM-T载体试剂盒、Trizol试剂及逆转录试剂盒(Qiagen公司);β2-m试剂盒(北京东雅生物技术有限公司)。ELX800酶标仪(美国BIO-TEKS公司);高速低温离心机3K-30(美国Sigma公司);荧光定量PCR仪。

1.3 治疗方法 亚砷酸联合T-VAD方案具体方法:①亚砷酸(arsenious acid，哈尔滨伊达药业有限公司，国药准字H19990191)，用法为10mg亚砷酸+500mL5%葡萄糖溶液，静脉滴注3～4 h，1次/d;②沙利度胺(江苏常州药业公司，国药准字H32026129)，用法为100mg，1次/d;③长春新碱(山东振东泰盛制药有限公司，国药准字 H14020811)，用法为长春新碱0.4mg/m2+20mL生理盐水，缓慢静脉注射，1次/d，用药时间为第1～4 d;④阿霉素(意大利 Actavis Italy S.p.A，注册证号H20130186)，用法为10mg阿霉素+50mL生理盐水，缓慢静脉注射，1次/d，用药时间为第1～4 d;⑤地塞米松(天津天药药业公司，国药准字H20033553)，用法为40mg地塞米松，1次/d，口服，用药时间为第1～4 d、第9～12 d及第17～20 d。常规治疗组采用VAD方案。4周为1个疗程，共进行2个疗程。对照组不采取任何干预措施。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 检测APRILmRNA及蛋白水平:清晨空腹取5mL外周血，经EDTA抗凝处理后提取血浆，分离留取单个核细胞。将β2M全序列作为内参，结合APRIL设计引物，合成荧光探针，成功构建APRIL及β2M标准品后，采用Trizol法提取并检测细胞总RNA的浓度和纯度，采取逆转录反应，扩增cDNA获取目的片段，PCR产物连接T载体，蓝白斑试验对重组质粒进行筛选，提取阳性克隆，采取EcoRⅠ酶切鉴定、测序、扩增、质粒抽提后应用核酸蛋白紫外分析仪进行定量分析，设5个APRIL或β2M标准品及6个对照复孔(空白及阴性各3个)，利用荧光定量检测仪进行PCR扩增，电脑软件计算β2M或APRILmRNA值。

1.4.2 检测血清APRIL及TPO:观察组患者在治疗前以及治疗结束后，对照组健康人群在体检当日，空腹状态下抽取5mL外周静脉血，加入129 mmol/L枸橼酸钠(比例为9∶1)抗凝处理后，在4℃环境中进行离心处理(3000 r/min)10 min，分离获取上清液，放置在－20℃冰箱中保存待测。依据ELISA试剂盒说明书进行血清TPO检测。

1.4.3 检测血清β2-m:在治疗前后清晨空腹下取3mL静脉血放置在消毒干燥试管内，抗凝处理后采取离心处理(3 000 r/min)，分离血清，置于－20℃冰箱中备用，依据试剂盒说明书，应用放射免疫分析法进行β2-m检测。

1.5 统计学方法 采用SPSS 16.0统计学软件分析实验所得数据，计量数据采用“±s”表示，计量数据分析为t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组APRIL mRNA水平比较 cDNA作为模板，琼脂糖凝胶电泳显示PCR扩增产物大小符合预期(见图1)。与对照组比较，MM患者APRIL mRNA表达显著升高(P＜0.05)，治疗后APRILmRNA仍处于高水平，但是其表达受到显著抑制，与常规治疗相比，观察组APRIL mRNA显著降低(P＜0.05，见表1)。

图1 琼脂糖凝胶电泳结果Fig.1 Agarose gel electrophoresis results

表1 各组APRILmRNA水平比较Tab.1 Comparison of APRILmRNA levels

2.2 各组血清APRIL、β2-m及TPO检测结果比较 观察组及常规治疗组患者血清APRIL、β2-m及TPO浓度显著高于对照组，经过治疗后表达水平虽然显著下降，但仍明显高于对照组(P＜0.05)，其中观察组下降水平显著优于常规治疗组(P＜0.05，见表2)。

表2 各组APRIL、β2-m及TPO检测结果比较Tab.2 Comparison of APRIL，β2-m and TPO detection results

2.3 观察组不同疗效患者的APRIL蛋白、β2-m及TPO表达水平比较 2个疗程结束后，有效组患者病情得到有效控制，其血清APRIL、β2-m以及TPO表达水平显著低于无效组(P＜0.05，见表3)。

表3 观察组不同疗效患者血清APRIL、β2-m及TPO表达水平比较Tab.3 Serum APRIL，β2-m and TPO expression levels in observation groupof patients with different curative effect

3 讨论

MM作为临床常见的恶性克隆性疾病之一，目前临床治疗多采用VAD方案，VAD虽然能够有效改善MM临床症状，但是其导致血管内皮功能损伤以及纤溶异常，增加血栓的风险［7］，并且其耐药性较高，临床治疗效果并不理想。亚砷酸及沙利度胺作为临床治疗多发性骨髓瘤的新药，研究发现［8］2者联合维生素C不仅具有减少新血管生成、抑制骨髓瘤细胞、调节细胞因子分泌及骨髓瘤细胞基因表达的作用，而且能够有效治疗多发性骨髓瘤，而且耐药性低、不良反应少。虽然MM发病机制与以及预后评估的相关性研究始终是临床的热点，但是关于亚砷酸联合T-VAD方案治疗老年多发性骨髓瘤的研究仍然较为匮乏。

本实验通过检测老年多发性骨髓瘤患者血清APRIL、β2-m及TPO的表达水平，对亚砷酸联合T-VAD方案的有效性进行评价。APRIL作为肿瘤坏死因子超家族的新成员之一，主要存在于外周血淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞以及肿瘤细胞内，能够对肿瘤细胞生长起促进作用［9］。罗泽宇等人［10］认为APRIL作为MM细胞增殖存活受体之一，不仅能够对MAPK以及PI3/AKT信号途径进行诱导，激活 COX-2活性，增加McL-1、BcL-2等从而促进抗凋亡蛋白的表达，提高PGE2生成量，从而促进骨髓瘤细胞增殖，延长其生存时间，而且能够抑制细胞死亡，促进破骨细胞活化，增强粘附作用，加速MM恶化，其可作为判断MM的有效指标。β2-m是体内重要的低分子量蛋白之一，其位于细胞膜，具有完整组织相容性，是HLA抗原的重要组成部分。江荣科［11］认为β2-m异常增高主要与瘤细胞分化、瘤细胞坏死、免疫系统受损后淋巴细胞活性增加，β2-m与HLA肿瘤抗原形成以及肾小球过滤下降有关，因此其能够较为准确地反映骨髓瘤细胞克隆及增殖活性，可作为MM评价疗效、判断预后的可靠指标之一［12］。TPO作为巨核细胞特异性促分化因子，不仅能够对巨核细胞的增殖、分化及成熟进行调控，而且能够分裂形成功能性血小板，TPO主要产生于肝脏、肾脏、脾脏及骨髓，能够调控机体造血功能，研究发现［13-14］MM患者血小板减少不仅与血小板寿命、血小板抗体及毒性物质有关，而且与TPO水平关系密切。本实验结果显示，与正常健康人相比，老年多发性骨髓瘤患者患者的血清APRIL、β2-m及TPO呈显著高表达，经过亚砷酸联合T-VAD治疗后，3者表达水平虽然仍高于健康人，但是与治疗前相比显著下降(P＜0.05)，而且有效组患者表达水平显著低于无效患者(P＜0.05)，提示亚砷酸联合T-VAD方案可能通过抑制血清APRIL、β2-m及TPO表达，有效治疗老年多发性骨髓瘤。综上所述，亚砷酸联合T-VAD方案能够降低血清APRIL、β2-m及TPO表达，显著改善老年多发性骨髓瘤治疗效果，值得临床应用。

［1］高绍华，李宝军.MPT方案治疗初治老年多发性骨髓瘤疗效观察［J］.山东医药杂志，2011，51(8):75-76.

［2］许力，林金盈，阳文捷.改良VAD方案治疗老年多发性骨髓瘤13例［J］.中国老年学杂志，2012，32(2):365-366.

［3］李雪芬，江聪法.地塞米松联合沙立度胺治疗多发性骨髓瘤临床观察［J］.实用肿瘤杂志，2010，25(1):84-85.

［4］庄文越，张吉林.多发性骨髓瘤骨病的机制与治疗［J］.北华大学学报(自然科学版)，2009，10(6):508-512.

［5］Durie BGM，Harousseau JL，Miguel JS，etal.International uniform response of criteria for multiple myeloma［J］.Leukemia，2006，20(9):1467-1473.

［6］向永胜.反应停联合三氧化二砷及维生素C治疗多发性骨髓瘤8例分析［J］.内科杂志，2008，3(4):506-508.

［7］刘竹珍，李广伦，杨颉，等.不同方案治疗多发性骨髓瘤患者血管内皮细胞功能的变化［J］.临床荟萃杂志，2014，29(2):155-158.

［8］黄妙儿，刘鹏，观美华，等.亚砷酸联合反应停、维生素C治疗难治性复发性多发性骨髓瘤疗效观察［J］.中国医学创新，2013，10(36):50-52.

［9］李敏燕，周凡，刘景华，等.多发性骨髓瘤患者血清B淋巴细胞活化因子和增殖诱导配体水平的测定及临床意义［J］.中华临床医师杂志(电子版)，2013，7(15):6998-6701.

［10］罗泽宇，申建凯，张广森.B细胞活化因子/增殖诱导配体在多发性骨髓瘤中的表达特点和临床意义［J］.临床血液学杂志，2009，22(3):120-124.

［11］江荣科.多发性骨髓瘤患者 β2-M、CRP水平的测定及临床意义［J］.中国保健营养杂志，2013，4(上):2116-2117.

［12］刘健，欧阳清，王晓桃，等.多发性骨髓瘤患者骨髓微血管密度和血清2－微球蛋白检测的临床意义［J］.山东医药杂志，2012，52(28):7-9.

［13］任明强，陈琦.多发性骨髓瘤血清TPO水平动态监测及临床意义［J］.遵义医学院学报，2006，29(2):122-123.

［14］沈文怡，陆化，费小明等.多发性骨髓瘤患者骨髓基质细胞IL-1β、IL-6、SCF、TPO 表达的研究［J］.肿瘤研究与临床，2007，19(11):732-734.