组织蛋白质组学在动脉粥样硬化疾病中的研究进展

张光伟+++刘恩岐

[摘要] 动脉粥样硬化是一种高致残率和致死率的疾病之一。其分子机制的初步探明已经为疾病的预防、诊断和康复检测提供一些重要的信息，但更深层次的机制未明。该研究概述了近年来蛋白质组学技术的发展，动物模型中动脉粥样硬化组织蛋白质组学以及人类的动脉粥样硬化组织蛋白质组学的研究进展，并就动脉粥样硬化组织蛋白组学存在的问题以及发展方向作了探讨。

[关键词] 动脉粥样硬化；机制；组织；蛋白质组学

[中图分类号] R543 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2014）06（c）-0195-02

动脉粥样硬化是血管壁广泛病变的疾病，从血管壁的轻度增厚、血管管腔的狭窄、冠状动脉闭塞到最终的心肌梗死。在发展中以及发达国家，该疾病是一种其分子机制的初步探明已经为临床的预防、诊断和康复检测提供一些重要的信息，但更深层次的机制未明。由于蛋白质在疾病的发生发展中发挥重要作用，蛋白质组学为进一步的探讨疾病机制提供了一种较理想的方法学。当前，动脉粥样硬化的蛋白质学研究主要集中在血清生物学标记的研究，然而组织蛋白质组学却可以深层次研究细胞因子的分泌、动脉壁或细胞。该综述报道了动脉粥样硬化的组织蛋白质组学最新研究进展。

1 蛋白质组学技术的发展

目前，蛋白质组学的分析技术已经历了两代，利用2DE为第一代蛋白分离技术应用于蛋白质组学；在质谱中的ESI发展和最新进展提供了第二代蛋白质组学的方法学，该技术主要以高相液相色谱为基础，称为Shotgun蛋白质组学或MudPIT。虽然经典的蛋白质组学方法部分被Shotgun蛋白质组学取代，但粥样斑块蛋白质组学的研究原则上还是主要依靠2DE分析。另外，其他的方法还有LC-MS/MS、抗体或印迹分析以及MS成像，最近组织微阵列（TMAs）是研究血管疾病蛋白表达的强有力的工具。

2 组织蛋白质组学在动脉粥样硬化的研究

2.1 动脉粥样硬化动物模型的蛋白质组学研究

apoE缺陷小鼠是研究动脉粥样硬化病理学最理想的动物模型。最近有两项研究以apoE缺陷小鼠为模型，利用2DE分析主动脉的差异表达。第1项研究为不同主动脉损伤（轻度、中度、重度）的小鼠与野生型小鼠比较，分析蛋白差异表达。在银染胶中鉴定出79个差异表达点，这些是缺陷小鼠动脉粥样硬化早期出现的免疫活性、氧化应激和能量损伤的蛋白质。特别是，抗氧化酶蛋白1-Cys只在野生型小鼠主动脉组织中发现，而氧化形式在apoE缺陷小鼠中高表达。研究还显示，谷胱甘肽还原酶和苹果酸酶的增加与粥样斑块氧化应激和抗氧化反应一致。更为有趣的是，在apoE缺陷小鼠粥样斑块中出现免疫球蛋白的沉积[1]。第2项研究针对apoE缺陷TLR2部分缺陷或完全敲除的小鼠的主动脉进行经典的蛋白质组学研究。报道显示，TLR2+/+小鼠的斑块内单核细胞侵润、凋亡、脂质含量和前炎症因子增加，平滑肌细胞减少。进一步确认，免疫系统与引起动脉粥样硬化进展的炎症反应的联系，另外还说明了TLR2在此过程中作用。Sypro Ruby胶的差异分析，7种代表氧化应激适应性反应的蛋白（顺乌头酸酶、延胡索酸水合酶、凝溶胶蛋白、血红蛋白、肌球蛋白轻链多肽3、SOD2和Vesl-2）在TLR2+/+小鼠的斑块高表达[2]。Almofti等利用高胆固醇饮食和维生素D3注射诱导大鼠动脉粥样硬化模型，研究主动脉差异蛋白表达，通过Colloidal Coomasie 2DE胶和质谱分析，鉴定出46个蛋白。18种在疾病组织中过表达，包括一系列氧化过程中的酶如抗氧化酶2、NADH脱氢酶、Fe-S；28种下调蛋白，包括CaM-kⅢ、转移酶、果糖双磷酸醛缩酶。任何一个验证试验都认为这些蛋白参与动脉粥样硬化过程[3]。外科学方法诱导的颈动脉狭窄大鼠模型，进行转录组和蛋白质组学研究，利用2DE和银染鉴定出16个表达差异点，其中5个为2到3个蛋白的复合体。最终鉴定19种蛋白，其中8种蛋白表达水平与转录水平一致。这些研究证实，转录组学可以不必考虑翻译和翻译后蛋白水平的调控[4]。

2.2 人类动脉粥样硬化标本的研究

目前，人类粥样斑块蛋白质组学的研究比动物模型更广泛。不同的蛋白质组学技术相继被应用，从Shotgun蛋白质组学或2DE到抗体阵列和质谱成像。用于研究的斑块标本大部分来自颈动脉组织活检。

3种经典的颈动脉组织提取物的蛋白质组学从2005相继报道[5-7]。含血栓的颈动脉斑块和稳定性斑块比较，进行蛋白质组学研究，结果在含血栓的斑块中α1-抗胰蛋白酶表达上调。该结果最终通过1DE和2DE的免疫印迹验证。α1-抗胰蛋白酶在炎症条件下，由肝脏表达，能够抑制胶原蛋白酶和弹性蛋白酶活性，可能提高斑块的纤维化[5]。Part等利用2DE对颈动脉动脉粥样硬化斑块核心区和周围正常区组织进行蛋白质组学研究。21种差异蛋白被鉴定出，其中hsp27被验证并进行进一步的分析[6]。该蛋白是第一个在颈动脉斑块分泌研究中发现的具有潜在的动脉粥样硬化生物标记物[8]。Part等研究发现hsp27在斑块核心区含量周围正常区下降。其他研究结果与以前的报道相反。免疫印迹显示，正常组织hsp27表达水平较非动脉粥样硬化区，血清hsp27在患者中也增加[6]。通过其他组的后续研究hsp27水平的下降与高损伤区的面积和斑块的不稳定性有关[7，9]。最新的2DE研究包括大量的被分为含稳定性和非稳定性斑块颈动脉标本，通过MALDI-TOF质谱从胶中鉴别出大量差异点。差异表达分析结果显示，在两组中含有9种差异蛋白，包括上调蛋白：铁蛋白轻链亚基、纤维蛋白原D、SOD2；下调蛋白：膜联蛋白A1、谷胱甘肽转移酶P1-1、HSP20、HSP27、RhoGDI、SOD3。免疫印迹验证了板块中含有高水平的纤维蛋白原D，该蛋白的效应为增加血管细胞内皮通透性、分裂、前炎症刺激、化学因子的释放。Sung等建立以主动脉组织活检为基础的斑块2DE。差异分析结果显示，39差异点增加，仅有少数几个点减少。过表达的蛋白利用MALDI-TOP MS进行鉴定，其中13在动脉粥样斑块组中所有胶的1或2中高表达，而其他14个在所有胶中高表达。3个高表达蛋白进行免疫印迹确认，两个蛋白在所用胶中上调，包括膜联蛋白A5和诱捕受体；1个蛋白仅在1或2块胶中高表达，该蛋白为14-3-3γ。该研究发现的下调蛋白可以作为疾病的生物学标记物如hsp27[10]。endprint

抗体阵列技术在最近几年获得了长足的发展。该项技术利用玻片的抗体点样与蛋白样本共同孵育，定量比较蛋白质表达水平，并进一步发展为化学发光技术。尽管该技术较简便，但仅见一例关于粥样斑块提取物的抗体阵列研究。Slevin等用512份抗体设置阵列探讨与稳定性斑块相比较不稳定性斑块蛋白水平的变化。共有21蛋白在稳定性斑块中高表达，3种蛋白水平在稳定性斑块增加。在不稳定斑块中过表达的蛋白有一些为以前研究确认上调的蛋白如：TNFα、HIFIα、hsp40、CRP2。11种有关炎症、血管生成、增殖和凋亡相关的蛋白通过免疫印迹和免疫组织化学进行确认，TNFα和HIFIα作为内参照。免疫印迹不仅对以上两组进行验证，另外加非动脉粥样斑块的颈动脉组。结果显示，与非粥样斑块组相比，在斑块（稳定性和非稳定性）所有11上调蛋白进一步确定8种蛋白，包括：TNFα、TRAF4、Gads、GIT1、Caspase-9、c-src、TOPOⅡ-α和JAM-1），免疫组化实验利用不同的细胞标志物蛋白抗体确定了在组织内表达特定蛋白的细胞类型[11]。

Martinet等利用印迹阵列研究颈动脉斑块和乳房动脉提取物的蛋白差异。他们使用了823份抗体分析信号转导蛋白，发现15种蛋白表达差异达5倍以上，但免疫印迹只确认7种蛋白，提示该方法易产生假阳性结果。尽管如此，有意义的蛋白在斑块中下调，其中之一与apoE过表达一致。血栓蛋白-2、MnSOD、apo B100、PTP1C在颈动脉中上调；ALG-2和糖原合成酶-3β下调。ALG-2的表达通过免疫组化和RT-PCR分析。免疫组化结果显示，该蛋白在乳房动脉和粥样斑块中低表达，提示通过该技术不能检测该蛋白在两种组织中的变化；RT-PCR也不能检测到差异，提示蛋白的调控为转录后水平[12]。

迄今为止，所有的动脉粥样硬化蛋白质组学研究的标本均为颈动脉或主动脉。虽然冠状动脉血栓的发生是心血管死亡率的最大危险因素，但因其取材的困难，还没广泛用于蛋白质组学的研究。第一个关于人类冠状动脉的蛋白质组学的报道为简短报道，研究者利用健康和疾病的冠状动脉进行2DE，并对胶银染。结果显示，铁蛋白轻链在冠状动脉中增加。免疫印迹确认了该结果；RT-PCR显示，铁蛋白轻链mRNA水平在病变动脉中减少，说明该蛋白为转录后水平的调控[13]。

最近，Bagnato等利用shotgun蛋白质组学研究冠状动脉斑块。该方法的对象为水解酶消化的组织，最后用MudPIT方法鉴定蛋白。直接蛋白质组学可以有效的应用冠状动脉组织。从石蜡包埋组织可以鉴定225种蛋白，然而，从冰冻组织中却可以鉴定出558种蛋白。而且他们对冠状动脉血管壁层进行了激光分离，LC-MS/MS分析分离层，共鉴定出806种蛋白。免疫组化确认了4种在动脉粥样硬化疾病进展中发挥作用重要蛋白，这些蛋白在以前未见报道。研究者期望用该方法发现冠状动脉提取物中生长因子和细胞因子，但由于浓度太低没能如愿。因此，他们使用AQUA方法结合多反应监控技术最终检测出传统shotgun蛋白质组学无法鉴定出的4种蛋白，包括：TGFβ、bFGF、PDGFβ和SDF-1α，其中TGFβ和SDF-1α可以被有效检测[14]。

3 小结与展望

伴随着蛋白质组学的快速发展，研究者们从动物模型和人类所获的动脉粥样硬化组织标本中，鉴定出了大量的差异蛋白。这些差异蛋白对探讨疾病的机制具有重要作用。但是该研究仍存在一些问题需要解决。首先，严重心血管事件（如心肌梗死和脑卒中）的发生主要由于是动脉粥样硬化斑块破裂所形成的血栓导致的。由于斑块破裂动物模型一直是研究动脉粥样硬化的瓶颈，因此导致斑块破裂的原因至今不明。若能够提高和改进获取破裂斑块的人类标本技术，并结合蛋白质组学技术，将在对斑块破裂机制的研究中起重要作用。其次，动脉粥样硬化是一种涉及多种蛋白、细胞和组织异常的复杂疾病病理过程。尽管人们已经利用分离动脉粥样硬化斑块组织进行蛋白质组学研究，然而这种组织分离技术还是不够精细。更精细的组织分离技术结合蛋白质组学是研究动脉粥样硬化机制的方向之一。另外，虽然人们已经鉴定出动脉粥样硬化差异蛋白，但是这些差异蛋白在动脉粥样硬化的发生发展中是伴随关系还是影响着疾病的进程，还需要做更深入的探讨。最后，组织中个别蛋白丰度较低和研究方法学通量不大和灵敏度较低等问题也是该领域需要克服的瓶颈。

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（收稿日期：2014-03-29）endprint