5－HT2B受体阻断剂对去甲肾上腺素诱导的肥厚心肌组织中心肌细胞凋亡的影响

白崇峰，于晋建，魏云炜，王 云，黎 涛

心肌细胞凋亡是心肌肥厚病理过程中的重要调节机制之一，在心脏功能由代偿向失代偿转化的过程中起着重要的作用［1］。研究心肌细胞的凋亡状况，对于了解心肌肥厚的程度以及心脏功能有着重要意义。近年来研究表明，5－羟色胺（5－hydrotriptamine，5－HT）可通过 5－HT2B受体参与诱导心肌肥厚［2－4］。笔者前期研究发现，在去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）诱导心肌肥厚的病变过程中，应用5－HT2B受体阻断剂可显著减轻心肌肥厚的程度［5，6］。本研究旨在观察应用 5－HT2B受体阻断剂对NE诱导的肥厚心肌组织中心肌细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1．1 主要试剂及配制方法 NE购自Sigma公司，用生理盐水（normal saline，NS）配制成浓度为 1．5 mg／ml的溶液。SB204741购自Tocris公司，用NS配制成浓度为2 mg／ml的溶液。两种溶液均4℃避光保存，1周内使用完毕。

TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自Promega公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自博奥森生物技术有限公司，兔抗鼠Bcl－2抗体和小鼠抗鼠Bax抗体购自Santa Cruz公司，兔抗鼠Caspase－3抗体购自Cell Signaling Technology公司，小鼠抗鼠β－actin抗体购自Sigma公司，鼠抗兔和兔抗小鼠酶标二抗分别购自Santa Cruz和Sigma公司。

1．2 心肌肥厚模型建立及分组 选择体重180～200 g雄性SD大鼠（动物及饲料均由第四军医大学实验动物中心提供）24只，随机分成3组，每组8只，分别为对照组，肥厚组、实验组。肥厚组和实验组采用腹腔注射 NE（1．5 mg／kg，2 次／d，28 d）的方法建立心肌肥厚模型，自第15天起实验组给予腹腔注射 SB204741（2 mg／kg，2 次 ／d），连续注射 14 d。对照组给予腹腔注射 NS 1 ml／kg，2 次 ／d，28 d。

1．3 观察指标

1．3．1 心肌肥厚指数 动物模型制备完毕后，将大鼠称重、处死，迅速开胸摘取心脏，用4℃生理盐水洗净，切除心房及右心室，用滤纸吸干心脏表面水分，称取左心室重量（LVW），计算左室重量指数（LVI），LVI＝LVW／BW（体重）。切取左室游离壁的心肌组织，横断后一部分迅速放入－70℃低温冰箱保存备用，另一部分移入10%甲醛溶液中固定备用。

1．3．2 TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况 标本固定72 h后，依次经过梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡浸透，最后经过包埋制作成石蜡块，用手动切片机切片，切片的厚度控制约为5 μm，用防脱载玻片加载切片。参照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书所述步骤，将各组心肌组织切片进行标记染色，在光学显微镜下观察并记录各组心肌组织中心肌细胞凋亡的情况。高倍镜（×400）下每张切片随机选取5个视野，计数凋亡阳性细胞，以凋亡指数（AI）反映各组心肌凋亡的情况，AI＝视野内凋亡心肌细胞个数／视野内所有心肌细胞个数×100%。

1．3．3 Western blot方法分析心肌组织中 Bcl－2、Bax以及Caspase－3的表达情况 将－70℃低温保存的心肌组织样品剪碎，加入组织裂解液，冰浴中用组织超声裂解仪裂解组织，然后12 000 r／min低温高速离心10 min，取上清液。参照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书，用BCA法对各组样品进蛋白定量，进而计算出电泳时所需的加样量。将蛋白样品与上样缓冲液按比例混匀后，放入沸水内煮沸5 min以使蛋白变性。8%SDS－PAGE电泳后，电转移至PVDF上，经封闭液封闭2～3 h，加入一抗，4℃孵育过夜，TBST洗绦10 min×3次，加入酶标二抗，室温下孵育 1～2 h，TBST 缓冲液洗涤 10 min×3 次，TBS缓冲液洗涤10 min。在暗室中发光、压片，然后显影、定影、拍照。用凝胶成像仪分析系统Quantity One软件扫描处理目标条带的净光密度值，并计算目的蛋白与β－actin灰度值的比值，分析各组心肌组织中 Bcl－2、Bax、Caspase－3 的表达情况。

2 结 果

2．1 心肌肥厚指数 如图1所示，与对照组相比，肥厚组大鼠则出现了明显的心肌肥厚，LVI显著增高（P＜0．01），说明该心肌肥厚模型是成功的。与肥厚组相比，实验组 LVI显著下降（P＜0．05）。此结果表明，应用5－HT2B受体阻断剂可减轻NE诱导心肌肥厚的程度。

图1 5－HT2B受体阻断剂对LVW／BW的影响

2．2 心肌细胞凋亡情况 TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况见图2。凋亡心肌细胞的细胞核被染成棕黄色，未凋亡心肌细胞的细胞核为深蓝色。如图所示，对照组的心肌组织中几乎见不到凋亡心肌细胞，肥厚组的心肌组织中TUNEL核染色剂阳性的细胞数量显著增加，AI明显上升（P＜0．01），说明该组心肌组织中存在大量心肌细胞凋亡。与肥厚组相比，实验组心肌组织中TUNEL核染色剂阳性的细胞的数量显著减少，AI明显下降（P＜0．05），提示应用5－HT2B受体阻断剂抑制了心肌细胞的凋亡。

2．3 心肌组织中 Bax、Bcl－2 以及 Caspase－3 的表达情况 Western blot检测结果如图3所示，经Quantity One软件扫描处理并进行统计学分析后，结果显示：与对照组相比，肥厚组心肌组织中Bcl－2的表达显著降低，Bax的表达显著升高，Bcl－2／Bax表达比例显著降低，同时Caspase－3的表达显著升高（P＜0．01）。而与肥厚组相比，应用 5－HT2B受体阻断剂SB204741的实验组心肌组织中Bax的表达显著降低，Bcl－2 的表达显著升高，Bcl－2／Bax 表达比例显著升高，同时Caspase－3的表达显著降低（P＜0．05）。该结果表明，在NE诱导心肌肥厚的病变过程中，应用5－HT2B受体阻断剂，可通过上调心肌组织中Bcl－2／Bax的表达比例， 降低Caspase－3的表达，抑制心肌细胞的凋亡。

图2 TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况（×400）

图3 5－HT2B受体阻断剂对肥厚心肌组织中Bcl－2／Bax及Capase－3表达的影响

3 讨 论

心肌肥厚是心脏为适应长期的血流动力学超负荷而发生的病理改变。在早期，心肌肥厚有利于心脏功能的维持，但随着病程的进展，最终将导致心力衰竭，甚至心源性猝死［7］。虽然到目前为止，心脏功能从代偿向失代偿转化的转换机制尚未完全阐明，但是，在其所有的可能机制中，心肌细胞的丢失很显然是一个非常重要的因素。研究表明，心肌肥厚过程中心肌细胞的死亡主要有凋亡、自噬性死亡和坏死3种类型［8］。与坏死和自噬性死亡不同，凋亡属于一种细胞的自杀行为，它由特殊编码的基因控制，可被多种病理生理的变化激活，以胞浆浓缩、核固缩、染色质聚集、DNA断裂、细胞变圆、细胞骨架坍塌及膜性凋亡体的形成为特征［9］。心肌肥厚时，心肌细胞凋亡的比例虽然很低，但在心肌肥厚向心力衰竭的转化过程中起着重要作用［1］。

NE作为交感神经系统最重要的神经递质，在心肌肥厚的发病过程中起着重要的作用［10，11］，其过度刺激可导致心肌肥厚的发生和发展。研究表明，NE可通过激活肾上腺素能受体或活性氧簇诱导心肌细胞的凋亡［12］。本实验中，笔者采用了腹腔注射NE的方法成功诱导出了心肌肥厚的动物模型，肥厚组和实验组动物均出现了明显的心肌肥厚。5－HT是人体内另一种重要的生物单胺，其受体在心血管系统广泛分布，并对心血管系统具有广泛的生理和病理作用［13］。近年来研究表明，5－HT 可通过 5－HT2B受体参与诱导心肌肥厚［2－4］。笔者前期研究发现，在去甲肾上腺素诱导心肌肥厚的病变过程中，应用5－HT2B受体阻断剂可显著减轻心肌肥厚的程度，降低心肌组织中5－HT的含量，并抑制5－HT2B受体表达的上调［5，6］。在本实验中，笔者应用 TUNEL 法检测了各组心肌组织中心肌细胞的凋亡情况。本研究发现，正常心室肌组织中几乎看不到凋亡心肌细胞，而NE诱导的肥厚组心室肌组织中凋亡心肌细胞的数量明显增多，AI明显上升，而实验组给予了SB204741处理后，其心肌组织中凋亡心肌细胞的数量显著减少，AI明显下降。该结果从形态学上证实，应用5－HT2B受体阻断剂可抑制NE诱导的肥厚心肌组织中心肌细胞的凋亡。

在心肌细胞凋亡过程中，除细胞出现特征性形态改变外，还涉及一些凋亡相关基因及蛋白的表达。抗凋亡蛋白Bcl－2可通过多种机制如直接抗氧化、抑制前凋亡蛋白、稳定线粒体膜等方式发挥抗凋亡作用。促凋亡基因Bax虽然与Bcl－2结构类似，但其作用却相反，它可与Bcl－2结合并阻止Bcl－2 的激活，发挥促凋亡作用［14］。因此，二者的比例关系决定了对细胞凋亡抑制作用的强弱。另外，Caspase－3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，也是凋亡的关键酶和执行者［15］。 因此，检测 Bcl－2、Bax以及Caspase－3的表达，有助于了解心肌组织中的细胞凋亡的状况。本研究检测了各组心肌织中 Bcl－2、Bax 以及 Caspase－3 的表达。研究发现，肥厚组心肌组织中Bcl－2的表达显著降低，Bax的表达明显增高，Bcl－2／Bax表达比例显著降低，同时，Caspase－3的表达显著增高，提示NE过度刺激诱导了心肌细胞的凋亡。而给予SB204741处理的实验组心肌组织中Bcl－2／Bax表达比率显著升高，Caspase－3的表达显著降低。由此可说明，在NE诱导心肌肥厚的病变过程中，应用5－HT2B受体阻断剂，可通过上调心肌组织中Bcl－2／Bax的表达比例，降低Caspase－3的表达发挥抗凋亡作用。

综上所述，在NE诱导心肌肥厚的病变过程中，应用5－HT2B受体阻断剂不仅可减轻心肌肥厚的程度，还通过可上调Bcl－2／Bax的表达比例，降低Caspase－3的活性发挥抗凋亡作用，亦即5－HT可能通过激活5－HT2B受体参与NE诱导的心肌肥厚和心肌细胞凋亡，其具体的细胞内作用机制仍需要进一步研究。

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