嘧菌酯在牧草和土壤中的残留规律研究

张志勇，简秋，宋稳成，孙星，杨邦保

（1.农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室 农业部农产品质量安全风险评估实验室（南京），江苏 南京210014；2.农业部农药检定所，北京100125）

嘧菌酯（azoxytrobin）是一种仿生合成的具有内吸性β-甲氧基丙烯酸酯类广谱杀菌剂［1-2］，其主要作用机理是线粒体呼吸抑制剂［3］。该药于1992年发现后，于1996年以Amistar（阿米西达）为商品名在欧洲首先开发，随后在1999年获得中国行政保护［4］。由于嘧菌酯具有杀菌广谱、持效期长、活性高、毒性低、对非靶标生物安全的特点，使其在新品种杀菌剂农药中拥有广阔的应用前景［5］。目前，嘧菌酯主要应用于果蔬、水稻（Oryza sativa）、人参（Panax ginseng）等作物，并对这些作物有很高的安全性［6-10］。国内外已有许多有关该药在农产品如芒果（Mangifera indica）［11］、葡萄（Vitis vinifera）［12］、西兰花（Brassica oleracea var.italica）和荷兰豆（Pisum sativum var.saccharatum）［5］、水［13］等的残留检测方法和在大豆（Glycine max）中的残留规律［14］以及其在人参和西洋参中的残留风险评估［15］等报道。我国许多地区牧草资源丰富、牧业发展前景好［16-17］，但牧草上容易出现枯萎病、黑粉病、炭疽病等病害，使用的杀菌剂也较多［18］，目前尚未见杀菌剂在牧草上的残留规律研究报道，因此，其在牧草上应用后对环境、人类的健康风险也未知。为保证该药在牧草上的合理使用和对环境、人类健康的保护，有必要开展其在牧草系统中的残留规律研究。本研究采用液质联用仪分析嘧菌酯在北京、江苏南京和河南郑州一年三地牧草和土壤中的残留动态和最终残留规律，以探明该药在牧草系统中的残留风险，为指导该药在牧草种植和管理中的合理使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

1.1.1 主要仪器 Agilent 1200SL-6410A液质联用仪，色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18 2.1 mm×150 mm（3.5μm）及ZORBAX SB-Aq Narrow-Bore Guard Column 2.1 mm×12.5 mm （5μm）（预柱）。

1.1.2 试剂 乙腈（分析纯用于样品提取；色谱纯用于流动相）；甲醇（分析纯用于样品提取；色谱纯用于流动相）；乙酸乙酯、丙酮和正己烷均为分析纯；Agilent氨基小柱（5 m L，1 g）；超纯水；嘧菌酯标准品：纯度98.0%（Sigma公司）；20%嘧菌酯水分散粒剂（市售）。

1.1.3 标样的配制 精确称取嘧菌酯标准品 （精确至0.1 mg），甲醇定容至50.0 m L，配成标准母液。再用空白牧草和土壤的提取液配制成0.01，0.05，0.10，0.25，0.50，1.00 mg／L系列浓度的标准工作液。配制好的标准工作液置于4℃冰箱中备用。

1.2 田间试验

参照《农药登记残留田间试验标准操作规程》［19］，于2012年分别在北京市、江苏省南京市、河南省郑州市3个试验点进行残留试验。各试验点分别设牧草低剂量（400 g a.i.／hm2，gram active ingredients）施药3和4次（间隔7 d施药1次），牧草高剂量（600 g a.i.／hm2）施药3和4次（间隔7 d施药1次）4个最终残留试验处理，同时设牧草残留消解动态和土壤消解动态（均为600 g a.i.／hm2）各施药1次2个消解动态处理，每个处理3次重复，每小区面积20 m2（4 m×5 m），同时设不施药对照小区。

最终残留试验处理牧草和土壤样品的采收：在最后1次施药后7，14和21 d后，随机在试验小区内不同方向及上下不同部位采集不少于1 kg生长正常、无病害、成熟的植株；同时用土壤采样器在试验小区内随机选6～12个采样点，采集地表以下0～15 cm土壤。

牧草残留动态试验处理牧草样品的采收：于施药后0 d（2 h），1，3，5，7，10，14和21 d采用随机的方法在试验小区内不同方向及上下不同部位采集不少于1 kg生长正常、无病害、成熟的植株。

土壤残留动态试验处理土壤样品的采收：于施药后0 d（2 h），1，3，5，7，10，14和21 d随机选取10个以上采样点，用土壤取样器随机取0～10 cm深土样1 kg左右。

1.3 样品制备

将采集到的牧草样本用捣碎机捣碎，装入密封袋中，贮存于－20℃冰箱内待分析。将采集到的土壤样本混合均匀，贮存于－20℃冰箱内待分析。

1.4 残留分析方法

牧草和土壤中嘧菌酯残留分析方法参考文献［10-12］并加以改进，具体提取净化和检测方法如下。

1.4.1 提取 称20.0 g牧草植株或土壤样品于125 m L试剂瓶中，加40 m L乙酸乙酯，匀浆2 min，振荡2 h，过滤，待分层取有机相液10 m L，氮吹至干，1 m L丙酮＋正己烷（1∶9，V／V）定容。

1.4.2 净化 氨基小柱用丙酮4 m L，正己烷2 m L预淋洗，加样液，加3 m L丙酮＋正己烷（1∶9，V／V），弃去流出液，用10 m L甲醇＋丙酮（1∶1，V／V）洗脱，收集洗脱液，氮吹至干，1 m L甲醇定容。

1.4.3 仪器条件 采用多重反应监测（MRM）模式。柱温：30℃；流动相为乙腈∶水（含0.1%甲酸）＝80∶20；流速：0.25 m L／min；进样量：5.0μL；离子源：ESI正模式；扫描方式：MRM；毛细管电压：4.0 k V；干燥气：10 L／min；温度：350℃；雾化气：30 psi。在上述条件下，嘧菌酯定量离子为295.3＞193.1（碰撞能量：25 e V），定性离子为295.3＞134.1（碰撞能量：55 eV），保留时间为2.9 min左右。

1.5 统计分析

采用Excel软件对结果进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 回收率与最低检出限

分别在空白牧草植株或土壤样品中添加不同质量分数的嘧菌酯标样（0.01，0.10，1.00 mg／kg），按上述提取、净化和仪器分析步骤进行测定，每个添加水平重复5次。添加回收试验结果表明，嘧菌酯在牧草植株中平均回收率为86.5%～97.4%，相对标准偏差为6.1%～10.3%；在土壤中平均回收率为82.4%～107.2%，相对标准偏差为2.3%～5.7%。该方法对牧草和土壤中嘧菌酯残留的最低检出限均为0.01 mg／kg。结果表明该方法符合 NY／T 788-2004《农药残留试验准则》的要求［20］。

2.2 嘧菌酯在牧草植株和土壤中的残留动态

嘧菌酯在北京市、江苏省南京市和河南省郑州市3个不同试验点牧草植株和土壤中的残留消解动态见图1和图2，降解动力学方程见表1。嘧菌酯在牧草和土壤样品中的降解计算采用一级动力学方程式（Ct＝C0e－kt），式中，Ct为处理t天后嘧菌酯在不同样品中的浓度，C0为起始浓度，k为一级动力学方程降解常数，半衰期（t0.5）＝ln 2／k［21-23］。试验结果表明，在施药当天，嘧菌酯在各试验点牧草中的残留量为1.43～3.22 mg／kg，在土壤中的残留量为1.55～4.21 mg／kg，随着采样时间的延长，牧草植株中嘧菌酯的含量均降低。嘧菌酯在不同试验点牧草中的原始沉积量差异较大（北京：1.43 mg／kg；江苏：3.22 mg／kg；河南：1.84 mg／kg），这可能由所种植牧草品种不同而引起的牧草植株表面积存在差异而导致农药在植株上的原始沉积量不同，也有可能是因为不同试验点的种植密度不同而导致牧草着药量不同。同时，施药的天气条件，如温度、相对湿度、风速等也有可能导致嘧菌酯在不同试验点牧草上原始沉积量存在差异。在施药后5 d，嘧菌酯在3个试验点牧草中的降解率均达到50%以上。施药后21 d，嘧菌酯在牧草中的降解率均达到了95%以上。在施药后5 d，嘧菌酯在3个试验点种植牧草土壤中降解率也均超过了50%，施药后21 d，嘧菌酯在3个试验点牧草植株中的降解率均为98%以上。嘧菌酯在牧草植株和土壤中的半衰期均较短，为2.9～3.7 d。在北京试验点牧草中的半衰期最长（3.4 d），在江苏省南京市的半衰期最短（2.9 d）。在河南省郑州市试验点土壤中的半衰期最长（3.7 d），在北京市试验点土壤中的半衰期最短（3.2 d）。

图1 嘧菌酯在牧草植株中的残留消解动态Fig.1 Degradation dynamics of azoxystrobin in forages

图2 嘧菌酯在土壤中的残留消解动态Fig.2 Degradation dynamics of azoxystrobin in soils

表1 嘧菌酯在牧草植株和土壤中的消解动力学方程Table 1 Degradation equations of azoxystrobin in forages and soils

2.3 嘧菌酯在牧草植株和土壤中的最终残留

按低剂量、高剂量分别施药3和4次后，在距最后1次施药7，14和21 d时牧草和土壤样品中嘧菌酯残留量见表2和3。嘧菌酯在牧草中的残留量为0.04～3.72 mg／kg。低剂量和高剂量施药3和4次处理，在最后1次施药后21 d，牧草中嘧菌酯均＜1 mg／kg。种植牧草的土壤中嘧菌酯的含量为0.11～3.21 mg／kg。结果还表明，在相同施药剂量和施药次数条件下，随着采样间隔期的延长，各试验点牧草植株和土壤中嘧菌酯的残留量随之下降；在相同采收间隔期和施药次数条件下，各试验点高剂量处理牧草植株和土壤中嘧菌酯残留量均高于低剂量处理；在相同采收间隔期和施药剂量条件下，各试验点牧草中的嘧菌酯残留量随着用药次数的增加而增加。

表2 嘧菌酯在牧草中的最终残留量（平均±标准差）Table 2 Final residue levels of azoxystrobin in forage（Mean±SD） mg／kg

表3 嘧菌酯在土壤中的最终残留量（平均±标准差）Table 3 Final residue levels of azoxystrobin in soil（Mean±SD） mg／kg

3 讨论与结论

由于嘧菌酯为第一个商品化的甲氧基丙烯酸酯类广谱杀菌剂，具有高效、广谱、保护、治疗、铲除、渗透、内吸活性等特点，几乎可以防治所有真菌（卵菌纲、藻菌纲、子囊菌纲和半知菌纲）病害。因此在我国已有约100个产品取得了登记，登记作物包括蔬菜、水果、粮谷类和牧草等。农药在农产品中的残留量受施药量、施药次数、采收安全间隔期、农药种类（化学结构）、剂型、施药时期及方式、农作物的种类及光、热、温度、湿度、微生物等环境因子的影响。在本研究中，嘧菌酯在3个试验点最终残留量和残留动态的原始沉积量均有较大差异，可能与施药环境和作物种类有较大关系。嘧菌酯每日允许摄入量（ADI）为0.02 mg／kg体重。目前我国尚未制定牧草中嘧菌酯的最大残留限量（MRL）。CAC残留限量标准中嘧菌酯在谷物饲料和干秸秆中的MRL值为15 mg／kg。为了保障牧草的安全，有必要研究嘧菌酯在我国不同典型牧草种植区域的残留规律和最终残留量，从而为尽快制定其在相关作物上MRL和其残留风险评估提供理论依据。

本研究所建立的牧草和土壤中嘧菌酯残留分析方法检出限低（0.01 mg／kg），前处理方法简便且效率高，完全能够满足市场监测和农药登记残留试验中嘧菌酯残留的检测。嘧菌酯按高低2个施药剂量、分别施药3和4次21 d后采样，牧草中嘧菌酯残留量均＜2 mg／kg，参照CAC制定的干秸秆和饮料中嘧菌酯的 MRL（15 mg／kg），按推荐的剂量施药21 d后采收牧草是安全的。