不同化学处理对稻草体外发酵动态变化的影响

马艳艳，李袁飞，成艳芬，朱伟云

（南京农业大学动物科技学院消化道微生物研究室，江苏 南京210095）

稻草是我国反刍动物主要粗饲料之一，但由于其粗纤维含量高，适口性差，消化利用率低，造成了资源浪费及环境污染。为了提高稻草的饲用价值，除了添加矿物质和能量饲料外，生产中常对其进行适当的加工处理。常见的处理方式有物理、化学和生物处理，其中化学处理又包括稀酸处理、碱化处理、氨化处理以及氨碱复合处理。化学处理能降低稻草粗纤维含量，提高粗蛋白含量。陈广银等［1］对秸秆进行碱化处理研究表明，碱化处理不仅能破坏木质纤维结构，也能破坏核酸、氨基酸等含氮物的结构，将其中的氮以NO3--N和NH4＋-N的形式释放，提高氮的利用率。

反刍动物通过瘤胃微生物发酵粗纤维获得能量，但秸秆中的木质素与纤维素和半纤维素相互交联［2］，导致瘤胃微生物难以降解利用。而化学处理则可破坏木质素与纤维素、半纤维素间的紧密连接，提高微生物对秸秆的降解率。同时，氨化处理可形成铵盐，提高秸秆的总含氮量，使微生物合成微生物蛋白所需的氮营养素含量增加，促进微生物增长［3］。王佳堃等［4］利用尿素处理稻草发现，尿素可以破坏纤维酯键，使纤维素暴露，加速纤维素和半纤维素的溶解。Rezaeian等［5］研究也发现，碱化处理能够提高木聚糖酶活性，从而提高秸秆降解能力。

目前，对秸秆化学处理的研究多侧重于处理前后营养成分变化的比较，而对瘤胃微生物发酵预处理秸秆的动态变化研究较少。本研究通过体外发酵技术研究化学预处理对秸秆发酵动态变化的影响，寻求提高稻草秸秆降解率的最佳处理方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 稻草采集与化学处理 稻草取自浙江大学农场。选择清洁、无污染及无霉变样品于65℃烘干，粉碎过1 mm筛并保存备用。分别添加3.6%NaOH与NH3·H2O、9%NH4HCO3及10%尿素对稻草进行复合碱化、氨化及尿素化处理。将原料混合均匀并拌湿后装入密封袋中压紧，堆放15 d后65℃烘干备用。不同化学处理稻草的营养成分含量见表1。

1.1.2 瘤胃液采集及培养基配制 瘤胃液采自南京农业大学江浦农场3头装有永久性瘤胃瘘管的健康成年荷斯坦奶牛。每天7：00和17：00饲喂干物质9 kg［青贮玉米秸秆∶苜蓿（Medicago sativa）∶羊草（Leymus chinensis）∶精料＝20∶20∶30∶30；精料主要由玉米（Zea mays）、麸皮、豆粕组成；先粗后精］，自由饮水。早饲前采集瘤胃液并保存于充满CO2的39℃热水瓶内，迅速带回实验室，整个过程严格厌氧。参照Theodorou等［6］方法配制培养基，然后与经4层纱布过滤的瘤胃液在厌氧条件下充分混合（体积比为10∶90），厌氧分装100 m L／瓶（含1 g发酵底物），39℃静置培养96 h。

1.2 测定指标与测定方法

1.2.1 常规营养成分分析 按美国公职分析化学师协会（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）［7］的方法测定试验样品中干物质（dry matter，DM）、粗蛋白（crude protein，CP）、粗脂肪（ether extract，EE）和粗灰分（ash content，Ash）含量，采用 Van Soest和Robertson［8］的方法测定中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）及酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）含量。计算底物干物质消失率（disappearance rate of dry matter，DMD）、中性洗涤纤维消失率（disappearance rate of neutral detergent fiber，NDFD）和酸性洗涤纤维消失率（disappearance rate of acid detergent fiber，ADFD）。

表1 不同化学处理稻草营养成分分析Table 1 Chemical composition of experimental roughages %

1.2.2 发酵指标测定 发酵过程中测定动态产气量，于24，48，72及96 h时结束发酵并测定发酵液p H值、挥发性脂肪酸（volatile fatty acids，VFA）、氨态氮（NH3-N）及微生物蛋白（microbial protein，MCP）浓度。参照Theodorou等［6］的方法测定产气量；参照秦为琳［9］的方法测定VFA含量；参照 Weathburn［10］的方法测定NH3-N浓度；采用考马斯亮蓝比色法测定MCP浓度。

1.3 数据分析

数据经Excel 2007初步整理后用SPSS 17.0进行One-Way ANOVA分析，用Duncan’s法进行多重比较。试验结果以平均值±标准误（Mean±SEM）表示，当P＜0.05时认为差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同化学处理对稻草体外发酵累计产气量的影响

图1 不同化学处理稻草体外发酵96 h累计产气量Fig.1 Cumulative gas production of rice straw with different chemical treatment in vitroCK：对照组Control；SH：碱化组Sodium hydroxide；AB：氨化组Ammonium bicarbonate；UR：尿素组Urea；下同The same below.

稻草体外厌氧发酵累计产气量变化见图1。各处理组体外发酵产气量变化趋势基本一致，发酵前36 h累计产气量迅速增加，随后增长缓慢。发酵36 h时，碱化组累计产气量最高，其次为尿素组和氨化组，对照组最低；发酵结束时，各组累计产气量差异显著（P＜0.05），碱化组最高，为（208.27±0.87）m L；其次为尿素组和氨化组，分别为（197.15±0.88）和（196.03±0.60）m L；对照组最低，为（192.18±0.43）m L；其中氨化组稻草和对照组差异不显著（P＞0.05）。

2.2 不同化学处理稻草体外发酵DMD、NDFD、ADFD变化

稻草体外发酵DMD、NDFD和ADFD变化见图2。各处理组DMD、NDFD和ADFD均随发酵时间的延长逐渐升高，其中碱化组稻草显著高于其他各组（P＜0.05），对照组最低，尿素组与氨化组间差异不显著（P＞0.05）。发酵结束时，碱化组与对照组相比，DMD由31.58%提高到51.36%，NDFD由63.62%提高到82.26%，ADFD由64.39%提高到71.37%。

图2 不同化学处理稻草体外发酵DMD、NDFD、ADFD变化Fig.2 DMD，NDFD，ADFD of rice straw with different chemical treatment in vitro

2.3 不同化学处理稻草体外发酵p H值变化

不同化学处理稻草体外发酵p H值变化见图3。各处理组发酵液p H值随发酵时间不断降低且发酵过程中尿素组p H值均为最高。发酵结束时尿素组和氨化组的p H显著高于对照组（P＜0.05），碱化组与其他各组差异不显著（P＞0.05）。

2.4 不同化学处理稻草体外发酵VFA变化

稻草体外发酵过程中VFA变化情况见表2。随发酵时间延长，各处理组VFA浓度逐渐升高；碱化、氨化和尿素组乙／丙呈先升高后降低的趋势，48 h时达到最高，而对照组乙／丙则逐渐降低。发酵结束时，氨化和尿素组发酵液中乙／丙显著低于其他2组（P＜0.05），其中氨化组和尿素组差异不显著（P＞0.05），碱化组和对照组差异不显著（P＞0.05）。发酵不同时间点各处理组相比，碱化组乙酸、丙酸、丁酸以及总挥发酸浓度均显著高于其他各组（P＜0.05），其次为尿素组和氨化组，对照组最低。

图3 不同化学处理稻草体外发酵的p H值变化Fig.3 p H value of rice straw with different chemical treatment in vitro

2.5 不同化学处理稻草体外发酵NH 3-N和MCP变化

稻草体外发酵NH3-N及MCP浓度变化见图4。随发酵时间延长，对照组和氨化组NH3-N浓度呈先升高后降低趋势，碱化组和尿素组则为升高－降低－升高。发酵各时间点不同处理组相比，尿素组NH3-N浓度均显著高于其他各组（P＜0.05），其次为氨化组和碱化组，对照组最低，碱化组与对照组差异不显著（P＞0.05）。不同化学处理稻草体外发酵MCP浓度介于13.54～20.64 mg／100 m L之间。随发酵时间延长，各处理组MCP浓度先升高后降低，发酵48 h时MCP浓度最高。发酵24，48及72 h不同处理组相比，尿素组MCP浓度最高，对照组最低，氨化组和碱化组差异不显著（P＞0.05），发酵结束时各处理组差异不显著（P＞0.05）。

表2 不同化学处理稻草体外发酵VFA变化Table 2 VFA of rice straw with different chemical treatment in vitro

图4 不同化学处理稻草体外发酵NH3-N和MCP浓度变化Fig.4 Concentrations of NH3-N and MCP of rice straw with different chemical treatment in vitro

3 讨论

3.1 化学处理对稻草营养成分及发酵特性的影响

本研究中复合碱化、氨化以及尿素化处理均提高了稻草粗蛋白含量，降低了NDF和ADF含量，这可能是因为化学处理不但增加了秸秆非蛋白氮含量，还破坏了木质素与纤维素、半纤维素间的酯键，使结构性多糖更易被降解。张浩［11］研究不同处理对稻草营养成分的影响时发现，经氨化处理后稻草粗蛋白含量提高了4.17%，增加了近1倍。邱向峰等［12］对饲用稻草预处理的研究表明，稀碱处理能大量溶出稻草中的半纤维素和木质素，从而提高稻草纤维素的糖化率。

本研究中碱化组累计产气量和干物质消失率最高，其次是尿素组和氨化组。这与已有报道一致。Liu等［13］研究显示，碱化稻草体外发酵产气量显著高于氨化稻草。庞云芝等［14］研究也显示，尿素、氨和NaOH处理均能提高稻草体外发酵产气量，但NaOH效果最好。艾丽霞等［15］对不同纤维底物体外发酵特性的研究表明，粗纤维含量较低，粗蛋白和无氮浸出物含量较高的底物体外发酵产气量较高。本研究中复合碱处理提高了稻草可发酵纤维比例及粗蛋白含量，从而提高了稻草干物质消失率和总产气量。

本研究中复合碱化处理显著提高了发酵液中VFA浓度，氨化处理显著提高了发酵液中NH3-N及MCP浓度。陈伟健等［16］在研究氨化处理稻草的体外发酵特性时发现，氨化处理能显著增加反刍动物瘤胃内主要纤维降解菌产琥珀酸丝状杆菌和黄色瘤胃球菌的数量，从而产生大量纤维素酶和半纤维素酶来加速底物水解增加还原糖生成量，最终大幅提高VFA产量［17］。氨化通过破坏木质素与多糖间的酯键，并与多糖形成铵盐，成为瘤胃内微生物合成菌体蛋白的氮源。同时，氨化处理通过添加外源氮的方式提高了稻草的含氮量，导致微生物发酵产生较高的NH3-N，同时改善了MCP的合成效率。

3.2 稻草发酵特性的动态变化

从稻草体外发酵动态变化看，瘤胃微生物在降解可消化养分的同时，伴随着产气量的增加、底物消失率的上升及VFA浓度的升高。由于发酵产生的VFA不能被及时消耗而累积造成p H持续下降。统计结果还显示，各处理组96 h累计产气量与其对应的DMD和VFA浓度呈显著正相关，相关系数分别为0.911和0.972；与p H呈显著负相关，相关系数为0.856。

瘤胃液中NH3-N和MCP浓度反映出日粮蛋白质降解与微生物蛋白合成间的动态平衡。本研究中，各处理组NH3-N变化趋势为升高－降低－升高，而MCP则呈先升高后降低的趋势，二者同时在发酵48 h时达到最高。饲料蛋白质中的易降解组分在培养初期能够迅速发酵，所以在发酵前48 h NH3-N和MCP浓度均有所升高；随着发酵时间延长，由于VFA等产物积累引起p H下降，从而影响微生物生长和对底物的降解，因此发酵后期NH3-N和MCP浓度有所降低。发酵液中NH3-N浓度在发酵后期呈先下降后升高的趋势，可能是细菌溶菌、纤毛虫自溶或纤毛虫的吞噬作用释放出氨所致。

4 结论

化学处理提高了稻草体外发酵累计产气量、干物质消失率以及挥发性脂肪酸浓度，其中碱化处理效果最好。