HPLC测定止咳祛痰灵中甘草酸、甘草苷的含量

江苏省泰州市中医院（225300）徐蓉

附图 止咳祛痰灵HPLC色谱图

止咳祛痰灵是我市中医院研制开发的中药制剂，主要由射干、紫苑、桔梗、甘草等多味中药组成，具有止咳、祛痰之功效，用于咳嗽、急慢性支气管炎等症状。其中甘草味甘、性平。具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药之功能[1]，为有效控制其内在质量，笔者参考有关文献[1]，建立了高效液相色谱法（HPLC法）测定止咳祛痰灵中甘草酸、甘草苷含量的方法。本法操作简便，甘草酸、甘草苷峰与其他组分峰分离良好，结果准确。

1 仪器与试药

1.1 仪器高效液相色谱仪：Waters2695/2996/Empower色谱系统。

1.2 试药 甘草酸铵、甘草苷对照品（供含量测定用，由中国药品生物制品检定所提供，批号为110731-200615、111610-200402）；止咳祛痰灵（泰州市中医院提供，20mL/支，批号：120326、120410、120606）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱Waters XBridge C18柱（4.6mm×150mm，3.5μm）；以乙腈为流动相A，以0.05%磷酸溶液为流动相B，按附表1进行梯度洗脱；检测波长为237nm；流速1.0ml/min；柱温：35℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取用五氧化二磷干燥至恒重的甘草酸铵、甘草苷对照品适量，加甲醇制成0.0579mg/ml、0.0750mg/ml的溶液，备用。（甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207）

2.2.2 样品溶液 精密量取样品1ml，置10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，取续滤液，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.3 阴性对照溶液：按处方量制备不含甘草药材的阴性样品，按样品溶液制备方法。制备阴性对照溶液。以上溶液各进样10μl，记录色谱图（附见图）。

2.3 线性关系考察 分别精密吸取对照品储备液配置成甘草酸浓度分别为0.0116、0.0232、0.0347、0.0463、0.0579mg/ml，甘草苷浓度分别为0.0150、0.0300、0.0450、0.0600、0.0750mg/ml的对照品溶液，分别进样10μl，记录峰面积，以浓度为横坐标，以峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，甘草酸回归方程为y=4450139x+29896，r=0.9999，甘草苷回归方程为y=4398177x+42094，r=0.9997，结果表明甘草酸对照品浓度在0.0116～0.0579mg/ml、甘草苷对照品浓度在0.0150～0.0750mg/ml范围内呈现良好的线性关系范围内呈现良好的线性关系。

附表1 流动相梯度洗脱表

附表2 甘草酸加样回收率

附表3 甘草苷加样回收率

附表4 样品含量测定结果（n=3）

2.4 精密度试验 精密吸取浓度为甘草酸浓度为0.0597mg/ml、甘草苷浓度为0.0750mg/ml的对照品溶液10μL，按照“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录甘草酸、甘草苷峰面积。甘草酸峰面积RSD为1.2%。甘草苷分面积RSD为1.0%。

2.5 重复性试验 取批号120326样品6份，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述高效液相色谱条件测定。结果甘草酸含量的RSD为1.1%，甘草苷含量的RSD为1.0%。

2.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10μL，按上述色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10、24h各进样1次，进行测定，RSD为1.0%。结果表明样品溶液在24h内稳定。

2.7 加样回收率试验 取批号120326样品（甘草酸含量为0.0913mg/ml，甘草苷含量为0.3707mg/ml）5份，精密量取1ml置10ml量瓶中，分别精密加入含甘草酸对照品0.0597mg/ml溶液2ml，0.0750mg/mL甘草苷对照品溶液5mL。照“2.2”项下方法制备供试溶液，按上述高效液相色谱条件测定，计算回收率，结果见附表2、附表3。

2.8 样品含量测定 精密吸取不同批号的样品，按样品溶液制备方法制备，在上述色谱条件下，进行含量测定（见附表4）。

3 讨论

3.1 甘草为止咳祛痰灵中的使药，甘草酸、甘草苷为其主要活性成分之一。为提高药品质量，确保疗效，笔者增加了含量测定方法，采用HPLC法对主要成分甘草酸、甘草苷进行定量。

3.2 关于甘草酸、甘草苷的HPLC法有很多文献报道[2][3]，笔者也对样品中甘草次酸含量进行了考察，但含量很低。流动相采用了《中国药典》2010年版一部甘草项下含量测定方法，对梯度洗脱进行了优化，并增加了平衡时间，结果色谱图中对照品与样品峰形好，分离度好，阴性对照无干扰，故采用此梯度洗脱方法。

3.3 实验结果显示， HPLC法测定止咳祛痰灵中甘草酸、甘草苷的含量，样品预处理简单，阴性对照无干扰，灵敏度高，准确性好，可作为止咳祛痰灵质量标准制定的参考。