高效液相色谱法测定四环素片的含量

天津市宝坻区药品检验所（301800）刘志会

四环素类抗生素系以具有共同多环并四苯酸基酰胺母核的衍生物，是一种广谱抗菌素，临床上主要用于革兰阳性菌、阴性菌感染，以及立克次体病、衣原体病、支原体病、螺旋体病的治疗。目前，四环素片的含量测定方法为中国药典规定的抗生素微生物检定法，收载于卫生部《药品标准·抗生素分册(第一册)》。该方法检验周期长，操作繁琐，影响因素多，易造成误差。且不能满足批量生产质量控制的需要。因此，笔者采用高效液相色谱法代替效价法测定四环素片的含量，该方法检验周期短、结果准确、重现性好、稳定性好，现介绍如下。

1 仪器与试药

1.1 日本岛津产UV-2401PC紫外分光光度计；日本岛津产LC-2010CHT高效液相色谱仪；梅特勒AG-135型电子天平；梅特勒TOLEDO型酸度计(精度：0.01 pH单位)；KQ-5200E型超声波清洗器；醋酸铵、乙二胺四醋酸二钠、三乙胺、醋酸、盐酸均为分析纯。一次性微孔滤膜(孔径0.45μm)。

1.2 四环素对照品(批号：130488-200103含量：97.5% 中国药品生物制品检定所) 四环素片3批：A药厂生产(批号：130904，规格：0.25 g)，B药厂生产(批号：131007，规格：0.25 g)，C药厂生产(批号：130313，规格：0.25 g)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱 phenomenexTM-C18(4.6 mm×250 mm，5μm)色谱柱；流动相 醋酸铵溶液【0.15mol/l醋酸铵溶液-0.01mol/l乙二胺四醋酸二钠溶液-三乙胺(100∶10∶1),用醋酸调节pH值至8.5】-乙腈（83∶17）；流速：1.0/min；柱温：30℃；检测波长：280nm；进样量：10μl。理论塔板数按四环素峰计算应不低于3 000，四环素峰与相邻杂质峰的分离度应符合中国药典2010年版二部附录VD规定(应不低于1.5)。

2.2 溶液的制备 精密称定盐酸四环素对照品26.29mg，置于50ml容量瓶中，用0.01mol／L盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取5ml，置于25ml容量瓶中，用0.01 mol／L盐酸溶液稀至刻度，摇匀,即得对照品溶液。取四环素片10片，精密称定，平均片重0.5408g,研细，精密称取0.5394g(约相当于四环素0.25g)，置于250ml容量瓶中，用0.01mol／L盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液5ml，置于50ml容量瓶中，用0.01 mol／L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

附图

附表 回收率测定结果

2.3 色谱测定 分别精密量取对照品溶液（0.1mg/ml）和供试品溶液（0.1m g/ml）各10μl ，注入液相色谱仪（自动进样）测定即得。见附图。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 精密量取盐酸四环素对照品溶液 （0.1mg/ml）10ul，注入高效液相色谱仪，重复进样6次，6次进样盐酸四环素峰面积分别为：1969243、1906511、1973703、1970883、1905326、1945634,平均为1945216，RSD为1.6%。

2.4.2 线性关系考察 取上述盐酸四环素对照品溶液(0.1mg/ml )，分别精取 1、3、5、10、20、40、60μl，注入液相色谱仪(自动进样)，记录色谱图。得各峰面积分别为190574、530381、888196、1893418、3781926、7509729、11204253，以进样量对峰面积进行回归，得回归方程：Y=187298X-5131.5，相关系数r=0.9999。

2.4.3 稳定性试验 取同一批号样品(批号：130904)，分别于0、3、5、7、10、12测定，供试品中四环素峰面积分别为：1901692、1880389、1878453、1850824、1835140、1805278，结果RSD为1.9% 。结果表明，样品在12小时内稳定。

2.4.4 重现性试验 取同一批号样品(批号：130904)，依供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，分别测定峰面积，计算四环素含量。结果测得平均含量为97.53%，RSD为0.47%(n=6)，试验结果表明该法重现性良好。

2.4.5 加样回收试验 精密称取已知含量(451mg/g)的样品6份，配置成所需浓度，和标准品溶液(0.5258mg/ml )，各5mL，置于50mL量瓶中，加0.01 mol/l盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液各10ul 注入液相色谱仪，记录色谱图，计算回收率，结果见附表。

2.4.6 样品含量的测定 取三批样品，依法制备供试品溶液，精密吸取10ul ，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算含量，结果批号为：A药厂生产（批号：130904，规格：0.25 g) ： B药厂生产(批号：131007 ，规格：0.25 g)： C药厂生产(批号：130313，规格：0.25g)的样品中四环素含量分别为97.7% 、91.8% 、96.4% 。

3 讨论

由于四环素是用生物发酵工艺制备的，含有一些杂质 ，在实验过程中如果遇到四环素主峰与相邻杂质峰分离效果不能满足实验要求时，可以减少乙腈的比例，改变流动相的极性，使四环素主峰的保留时间延长，达到其与杂质峰分离的目的。具体改变多少，依据实验条件反复摸索而定。如果流动相的pH值大于8，应采用耐碱的色谱柱，否则,会使链端的结构被“置换”或改变，从而加速硅胶的溶解而释放出絮状物堵塞柱子，长时间使用会造成色谱柱柱效降低。