p16、p53和Ki67在宫颈癌中的表达及其临床意义

雷 蕾，叶 斌，王西川

(成都市第六人民医院 a.肿瘤科，b.病理科，四川 成都 610051)

宫颈癌是一种发生在子宫颈上皮的恶性肿瘤，也是全球妇女中仅次于乳腺癌的第二个最常见恶性肿瘤，其发病率在我国居女性生殖道恶性肿瘤第一位，发病年龄高峰为40～60岁。宫颈癌最常见的组织学类型是鳞状细胞癌，其发病机制尚不完全清楚，但现有的研究表明宫颈癌的发生、发展是由宫颈鳞状上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)到浸润癌的连续发展过程［1］，是多种癌基因和抑癌基因的表达、调控以及细胞凋亡参与的多步骤的复杂过程［2］。p16是一种新型抑癌基因，参与了肿瘤发生发展的周期调控。p53基因是重要的抑瘤基因，分为野生和突变两种亚型，是细胞增生的主要负调控子，该基因的突变或缺失是导致许多肿瘤发生的原因。Ki67是一种细胞增殖核抗原，其表达与多种肿瘤的发生、发展、浸润、转移有关。本研究采用免疫组化方法检测宫颈炎和宫颈癌组织中p16、p53蛋白和Ki67表达情况，以探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集我院妇产科2007年4月至2013年10月宫颈活检/锥切及手术标本共92例，其中宫颈癌52例，患者年龄32～85岁，中位年龄55岁;CIN40例，患者年龄30～64岁，中位年龄50岁。同期宫颈炎标本26例用于对照，患者年龄35～78岁，中位年龄50岁。所有标本均经组织病理确诊。患者术前均未接受过放化疗。宫颈癌患者临床分期按2009版FIGO分期标准:Ⅰ期14例，ⅡA期8例，ⅡB期6例，Ⅲ期13例，Ⅳ期11例。宫颈癌病理分级:G1 10例，G2 10例，G3 32例。周围淋巴结转移情况:发生淋巴结转移者25例，未发生淋巴结转移者27例。

1.2 检测方法 采用免疫组化PV-9000法。所有抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。石蜡包埋，制成4 μm厚的切片。脱蜡、水化组织切片;高压锅抗原热修复;3%H2O2去离子水孵育以阻断内源性过氧化物酶;滴加一抗，4℃过夜;PBS冲洗，滴加聚合酶辅助剂，37℃孵育20 min;PBS冲洗后滴加辣根酶标记山羊抗小鼠IgG多聚体，37℃孵育30 min;应用DAB溶液显色;自来水冲洗、复染、脱水、透明、封片。

1.3 结果判断 于显微镜下观察，每例观察2张切片，每张切片随机选择10个高倍视野，每个视野计数100个肿瘤细胞，取其平均值为细胞的阳性率。结果判断:p16阳性定位在细胞核和(或)胞浆;p53和Ki67阳性定位在细胞核。凡是呈现清晰的棕黄色颗粒为阳性，阳性细胞数所占比例＜10%为阴性(-)，比例≥10%为阳性(+)。

1.4 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，计数资料以频数表示，进行χ2检验，多个样本间的比较采用卡方分割法(调整后P'＜0.016为差异有统计学意义)，相关性分析采用Spearman等级相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癌组织、CIN与宫颈炎组织中 p16、p53和Ki67的表达 p16、p53蛋白及Ki67在宫颈癌、CIN中、宫颈炎中表达差异有统计学意义(P＜0.05);两两比较显示p16、p53蛋白及Ki67在宫颈癌、CIN组织中的阳性表达率均显著高于宫颈炎(P＜0.05)，见表1。

表1 宫颈癌组织、CIN组织和宫颈炎组织中p16、p53蛋白及Ki67的表达 ［n(%)］

2.2 宫颈癌组织中p16、p53及Ki67蛋白表达与临床病理特征的关系 52例宫颈癌中，p16、p53蛋白及Ki67的阳性表达与临床分期和组织学分化程度有关(P＜0.05);与淋巴结转移和年龄无相关性(P＞ 0.05)，见表2。

2.3 宫颈癌组织中p16、p53和Ki67蛋白表达之间的关系 52例宫颈癌中，p16和Ki67蛋白同为阳性者21例，同为阴性者10例，p16与Ki67的表达相关(χ2=4.805，P=0.028);p53 和 Ki67 蛋白同为阳性者19例，同为阴性者11例，p53与Ki67的表达相关(χ2=5.983，P=0.014)，见表 3。

表3 P16、P53和Ki67在宫颈癌组织中表达的相关性分析 (例)

3 讨论

宫颈癌标志物的检测可反映肿瘤的生物学特性，对诊断、治疗及预后具有重要意义。p16基因又称MTS1(多肿瘤抑制基因)，为细胞周期依赖性激酶(CDK)抑制蛋白，是1994年6月由Kamb报道的一种新型抑癌基因［3］。p16与细胞周期素D(Cyclin D)竞争CDK4、CDK6，通过抑制它们的活性，使其一系列底物(如Rb)保持持续去磷酸化高活性，而不能解除pRb对转录因子E2F等的抑制，最终阻止细胞由G1期进入S期，直接抑制细胞增殖［4］。研究表明，在许多肿瘤中均有p16的突变 、缺失，导致细胞周期调节紊乱，使细胞无限制增生，甚至癌变。孟庆更等［5］发现，p16阳性表达与HPV感染密切相关，且可作为筛查宫颈癌及其癌前病变的重要指标。Carozzi等［6］发现，p16检查可预测HPV阳性女性发生高级别宫颈上皮内瘤样病变或更差临床状况的风险。本研究结果显示，p16蛋白在宫颈癌组织的阳性表达率为44.23%，CIN组织中的阳性表达率为35%，均明显高于宫颈炎组织，结果与郭建华等［7］研究相符。且在本研究中，蛋白p16的阳性表达与宫颈癌的临床分期和组织学分化程度有关(P＜0.05)，蛋白p16在ⅡB期以上的阳性表达显著高于Ⅰ期和ⅡA期(P＜0.05)。上述结果提示p16突变与宫颈癌的发生、发展有关，提高检测可用于高级别CIN和宫颈癌的早期诊断，与宫颈癌临床分期及病理相结合，可用于判断预后。

p53蛋白是重要的细胞生长负调节因子，p53基因突变导致对细胞周期的调节功能丧失，使细胞异常增殖和恶性转化。它与细胞周期蛋白(cyclins)结合形成复合体，抑制依赖细胞周期蛋白的相关激酶(CDKs)活性，使细胞停滞在G1期或引起细胞程序性死亡，从而消除可能癌变的异常细胞［8］。p53基因大约有50%的突变率，当p53基因发生突变时，可导致稳定的蛋白质不能完成抑制细胞增殖的作用，并且促进细胞恶性转化，使p53基因由抑癌基因转为原癌基因［9］。由于野生型p53蛋白代谢不稳定，半衰期仅20～30 min，且细胞内含量低，因此，用免疫组化方法不能检出;突变型p53蛋白半衰期延长(数小时)，细胞核内出现突变型p53蛋白的集聚，因而用免疫组化方法能够检出［10］。本研究结果显示，p53蛋白在宫颈癌和CIN组织中的阳性表达率明显高于宫颈炎组织。同P16相似，蛋白p53的表达与宫颈癌的临床分期和组织学分化程度有关(P＜0.05)，与淋巴结转移及年龄无关(P＞0.05)，与楼朝霞等［11］研究相符。上述结果提示p53突变在CIN到宫颈癌的发生发展中起重要作用，其检测可作为癌前病变和宫颈癌早期诊断及指导预后的一项重要指标。

Ki67抗原是Gerdes等于1983年发现的在增殖细胞中表达的一种核抗原，也是目前较为肯定的核增殖标志。主要功能与细胞合成代谢有关。除了G0期和G1早期外，其他各期均有此抗原表达，恶性肿瘤中常呈高表达［12］。已有研究显示，Ki-67抗原与肺癌、淋巴瘤、乳腺癌、头颈部癌、消化道肿瘤等密切相关，可能与这些肿瘤的发生、发展、分级、分期、浸润和转移、复发及预后等各方面均有相关性［13］，可作为诊断、预测疗效和预后等方面的标志物。本研究中，Ki67抗原在宫颈癌和CIN组织中的阳性表达率明显高于宫颈炎组织(P＜0.05)，提示在宫颈上皮细胞癌变过程中，细胞增殖活性逐渐增强。Ki67的阳性表达在不同临床分期和组织分化程度的宫颈癌标本中差异有统计学意义(P＜0.05);而在宫颈癌有无淋巴结转移和不同年龄，差异无统计学意义(P＞0.05)。提示Ki67对鉴别宫颈癌及宫颈炎有重大的意义，且与宫颈癌的诊断及预后有一定的相关性。有研究提出，有淋巴结转移者Ki67高于无淋巴结转移者，本结果似有不同，考虑与临床检查诊断有无淋巴结转移尚存在一定困难有关，有待进一步研究。

综上所述，宫颈癌中p16、p53及Ki67基因表达上调，与宫颈癌的发生、发展密切相关，将三者作为生物标志物进行联合检测，有利于对宫颈癌患者恶性程度及预后的评估。

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