半仿生－酶法提取中药不同成分的比较研究

戴柳江，张 卉，李梦怡，席 可，郭增军（西安交通大学药学院，西安 710061）

半 仿 生－酶 法 （semi－bionic enzyme extraction，SBEE）是将半仿生提取法与生物酶提取结合起来提取中药药效物质的一种新方法。该法模拟口服给药及药物经胃肠道转运的原理，将药材在常温、常压下，选择适当的酶进行酶解，破坏其细胞壁，以不同pH的水为溶剂对药材进行连续提取得到含指标成分较高“活性混合物”的一种新型提取方法［1］。该方法是在半仿生基础上加入生物酶进行酶解，是半仿生法的进一步仿生［2］。

文献报道，有研究者曾用半仿生－酶法对三萜皂苷类［2－6］、糖苷 类［7］、酚 酸 类［8－9］及 黄 酮 类［10－11］都 做 过相关的研究。通过运用该法对复方药与单味药研究的结果表明，与其他传统溶剂提取方法相比，半仿生－酶法提取不同有效成分都显示出一定优势。例如：王淑玲［2］、孙福东［3］在运用不同溶剂法提取半夏白术天麻汤方药成分时，以SBEE法为佳。杨光义等［8］运用半仿生法、酶法及半仿生－酶法提取丹参水溶性成分的比较研究，发现半仿生－纤维素酶法所得综合评价指标最优。雒馨怡等［10］通过对鹿衔草总黄酮的酶联半仿生法提取工艺进行优化，优化后所得总黄酮提取率远远高于传统醇提所得。为了进一步研究半仿生－酶法在不同中药及不同成分中的应用，作者选取甘草、槐米和黄连3种药材作为半仿生－酶法的研究对象，分别以3种药材中的主要成分甘草酸、芦丁和小檗碱含量以及各自的总浸膏得率为指标，先通过正交实验，优化得到3种药材半仿生－酶法的最佳工艺条件，再通过将半仿生－酶法最佳工艺下3种成分的含量与水提法、酶法、半仿生法和传统醇提法所得含量进行比较，研究半仿生－酶法对上述不同有效成分的提取效果，初步确定半仿生－酶法的适用范围。

1 仪器与试药

1.1 仪器 CS1011型电热鼓风干燥箱（重庆实验设备厂）；PHS－3C型pH计（上海佑科仪器仪表有限公司）；Mettler AE240 电 子 天 平 （Mettler－Toledo Group）；KQ3200B型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；SHZ－D（Ⅲ）循环水式真空泵（河南巩义英峪予华仪器厂）；Thermo Spectra System P2000高效液相色谱仪（美国 Thermo公司）；DK－98－IIA型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；UV－1800型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）。

1.2 试药 3种药材均购于西安市药材市场，经郭增军教授鉴定甘草为豆科植物甘草（Glycyrrhiza uraiensis Fisch）的干燥根及根茎，槐米为豆科植物槐（Sophora japonica L.）的干燥花蕾，黄连为毛茛科植物黄连（Coptis chinensis Franch.）的干燥根茎；甘草酸（110731－201116）、芦丁（100080－200707）、盐酸小檗碱（110713－200609）对照品均购自中国药品生物制品检定所；果胶酶（3×105U·g－1）、纤维素酶（3×104U·g－1）、β－葡聚糖酶（5×105U·g－1）均购自宁夏和氏璧生物技术有限公司；色谱纯乙腈（天津市科密欧化学试剂有限公司）；蒸馏水，自制三蒸水；乙醇、市售磷酸、十二水合磷酸氢二钠、一水合柠檬酸均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 实验设计

2.1.1 半仿生－酶法 根据仿生学原理，人体胃、小肠、大肠的体液pH 值为2.0，7.5和8.3。分别称取各药材10g，加柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液适量，调pH值至2.0，50℃恒温振荡2h，然后调pH值至4.5，再加入适量的酶酶解50min，滤过，滤渣依次加入pH分别为7.5和8.3的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲溶液作为提取液水浴提取，合并全部提取液，浓缩得到干浸膏。

2.1.2 半仿生－酶法正交实验优化工艺 为了获得各药材半仿生－酶法的最佳工艺，在确定半仿生－酶法的操作步骤后，选定提取温度、料液比和时间作为考察的3个因素，每个因素各取3个水平：水浴温度（60，70和80℃），料液比（1∶10，1∶14和1∶18g· mL－1）提取时间（1.5，2.0和2.5h）。采用L9（34）正交表进行实验，以主成分含量和干浸膏收率的综合评分（综合评分＝主成分含量×4＋干浸膏收率×1）为考察指标，考察因素间的最佳配比。

2.1.3 不同提取方法比较

（1）纤维素酶法 分别称取各药材10g，加水80mL，50℃恒温振荡2h，调pH值至4.5，再加入适量的纤维素酶，在50℃酶解50min，滤过，药渣依次加入50mL蒸馏水，水浴提取2.5h（槐米为2h），合并提取液，浓缩得到干浸膏。

（2）水提法 分别称取各药材10g，分别加水80mL，50℃恒温振荡2h，继续在50℃水浴提取50min，滤过，药渣依次加入50mL蒸馏水，水浴提取2.5h（槐米为2h），合并提取液，浓缩得到干浸膏。

（3）半仿生法 称取各药材10g，加柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液80mL，调pH值至2.0，50℃恒温振荡2h，继续于50℃水浴提取50min，滤过，滤渣依次加入pH为7.5和8.3的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲溶液50mL水浴提取2.5h（槐米为2h），合并提取液，浓缩得到干浸膏。

（4）传统醇提法 分别称取各药材10g，用100mL体积分数70%乙醇浸泡30min，加热回流2h，滤过，药渣再加入100mL体积分数70%乙醇回流2h，滤过，合并2次滤液浓缩得到干浸膏。

2.1.4 干膏收率的计算 将上述不同方法所得各提取液置于旋转蒸发仪上，蒸至近干后，转移到蒸发皿中，于水浴锅中挥干，再置于真空干燥箱中，60℃烘至恒质量，于干燥器中冷却30min，称定质量，即为提取物总量，计算干膏收率（干膏得率＝提取物总量／加入药材干粉总量×100% ）。

2.1.5 有效成分含量的计算 通过计算得出各药材中有效成分甘草酸、芦丁和小檗碱的质量，计算有效成分含量（有效成分含量＝测得的有效成分质量／加入药材干粉总量×100%）。

2.1.6 各方法比较的综合评分计算 参见2.1.2中综合评分计算公式。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

（1）甘草酸 Diamonsil TM C18（250mm×4.6mm，5μm），前加预柱（10mm×4.6mm）；UV检测波长：247nm；柱温：室温；流动相：乙腈－0.5mL·L－1磷酸溶液 （40∶60）；流速：1.0mL·min－1。

（2）芦丁 Promosil C18（L）（150mm×4.6mm，5μm），前加预柱（10mm×4.6mm）；UV 检测波长：257nm；柱温：室温；流动相：甲醇－10mL·L－1磷酸溶液 （32∶68）；流速：1.0mL·min－1。

（3）盐酸小檗碱 Promosil C18（L）（150mm×4.6mm，5μm），前加预柱（10mm×4.6mm）；UV检测波长：345nm；柱温：室温；流动相：乙腈－0.05mol·L－1磷酸二氢钾溶液 （50∶50）；流速：1.0mL·min－1。

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取甘草酸对照品10mg，精密称定，置于50mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。分别精密称取芦丁和盐酸小檗碱对照品1mg，精密称定，置于10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 供试品溶液制备 取按2.1.3项下得到的干浸膏适量，精密称量，置于10mL量瓶中，定容，用0.45μm微孔滤膜滤过，得供试品溶液。

2.2.4 线性关系考察 精密称取2.2.2项下对照品储备液0.20，0.40，0.60，0.80，1.00和1.20mL，置于10mL量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀；用0.45μm微孔滤膜过滤后，各精密吸取20μL，按照上述色谱条件测定。以进样质量浓度C（μg·mL－1）为横坐标、峰面积为纵坐标，进行回归，制备标准曲线。得到的甘草酸、芦丁和盐酸小檗碱的回归方程分别为：

2.2.5 精密度实验 精密吸取甘草酸、芦丁和盐酸小檗碱对照品溶液，按上述色谱条件重复进样6次，每次20μL，测定组分的峰面积，计算得到各成分的峰面积的RSD分别为0.89%，1.57% 和1.61%。

2.2.6 重复性实验 按2.2.3项下方法制备各供试品溶液6份，精密吸取20μL，按2.2.1项下条件测定，取平均值，结果甘草酸、芦丁和盐酸小檗碱质量浓度的 RSD值分别为1.55%，1.78% 和1.39%。

2.2.7 稳定性实验 按照上述条件分别制备供试品溶液。精密吸取同一供试品溶液20μL，分别于0，2，4，6，8，10，12和24h测定，结果甘草酸、芦丁和盐酸小檗碱在24h内质量浓度稳定。其RSD分别为1.65%，1.26%和1.23%，说明供试品溶液在24h内稳定。

2.2.8 回收率实验 分别精密称定已知含量的3种不同浸膏适量，用流动相溶解后分别加入不同量的对照品溶液。按照2.2.3项下方法制备供试液，按2.2.1项下条件测定。分别取20μL 进样，进行HPLC分析，记录色谱图，测定峰面积，计算其平均回收率分别为96.88%，100.75%和103.61%。

2.3 测定结果 3种药材半仿生－酶法按2.1.2项进行正交实验优化工艺，结果见表1至表3所示。

表1 甘草的半仿生－酶法正交实验结果Tab.1 Orthogonal design and results of licorice root by semi－bionic enzyme extraction

表2 槐米的半仿生－酶法正交实验结果Tab.2 Orthogonal design and results of sophora flower bud by semi－bionic enzyme extraction

表3 黄连的半仿生－酶法正交实验结果Tab.3 Orthogonal design and results of coptis by semi－bionic enzyme extraction

直观分析上述结果，发现3种药材的半仿生－酶法正交实验结果具有一定重复性。在3种药材的半仿生－酶法提取中，影响因素由大到小依次均为：B＞A＞C。用SPSS软件对正交实验数据进行方差分析，甘草、槐米和黄连的半仿生－酶法的分析结果见表4。从方差分析结果可以看出，在提取槐米和黄连中有效成分时，因素B（料液比）对实验结果影响显著（P＜0.05），而因素A（温度）与C（提取时间）对实验结果影响不大。而各因素对甘草中有效成分的提取影响均不显著。综上，甘草和黄连的半仿生－酶法最佳条件均为A3B3C3，即水浴温度为80℃，料液比为1∶18，提取时间为2.5h。而槐米的最佳工艺为A3B3C2，水浴温度为80℃，料液比为1∶18，提取时间为2.0h。

表4 正交实验的方差分析结果Tab.4 Analytical results of variance

半仿生－酶法与各方法比较，结果见表5。结果显示，对不同药材的提取，与其他以水为溶剂的提取法相比，半仿生－酶法综合评分最高，具有一定优势。不同药材之间进行比较，应用半仿生－酶法提取甘草中有效成分得率更接近传统醇提所得得率。

表5 半仿生－酶法与各方法比较的结果Tab.5 The results of different methods comparison

3 讨论

本实验分析比较了半仿生－酶法在甘草、槐米、黄连等药材中的应用效果。本文的创新之处在于：第一，首次运用半仿生－酶法提取3种药材甘草、槐米和黄连。第二，运用半仿生－酶法系统比较不同类别成分的提取，并将其与其他方法进行对比研究。本实验所得结论可以为今后运用半仿生－酶法提取不同类别成分提供一定参考依据。

在前期工作中，通过查阅文献并进行不同种类酶提比较，最后优选了纤维素酶作为本次实验用酶。多篇文献报道，纤维素酶适用于多种类型有效成分的提取［12－14］。同时有文献指出，在纤维素酶的作用下，部分甘草酸会水解［15］。也有研究者［16］曾对半仿生法提取甘草中甘草酸的工艺进行过优化，甘草酸收率与本实验中半仿生－酶法所得结果十分接近。纤维素酶的存在一方面增大了甘草酸的溶出率，另一方面又可能对其有一定分解作用。总体效果表现出与半仿生法得率接近。猜测其他成分如甘草酸分解产物甘草次酸的含量会有增加。而其他2种药材槐米和黄连中主要成分分别为黄酮类和生物碱类，结果显示其半仿生－酶法得率较低。可能是由于黄酮类物质极性较小，在以水为溶剂的方法中提取得率较低。这一结论与文献报道不一致［10］，是后期工作中应该重点研究的。而生物碱类化合物如小檗碱较易氧化分解，可能是由于当采用半仿生－酶法提取该类化合物时浓缩得到浸膏后，小檗碱较长时间暴露于空气中被氧化，导致最后测得含量偏低。

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