阜康阿魏内生真菌的组成及分布△

朱军，孙丽，，李晓瑾，*，赵丽，石书兵

(1.新疆中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐 830002；

阜康阿魏内生真菌的组成及分布△

朱军1，孙丽1，2，李晓瑾1，2*，赵丽3，石书兵2

(1.新疆中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐 830002；

2.新疆农业大学 农学院，新疆 乌鲁木齐 830052；

3.新疆医科大学 中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011)

目的探索阜康阿魏植物内生真菌的组成及分布，为进一步深入研究其作用机理及应用价值提供理论依据。方法采用微生物学研究方法与技术，对阜康阿魏的不同生长期、不同部位中的内生真菌进行了分离，并利用形态和分子生物学方法对其鉴定。通过分离频率、Shannon-Wiener多样性指数和系统发育树等分析阜康阿魏内生真菌的组成、分布及多样性。结果本研究共分离得到内生真菌59株，分别归属于20个分类单元，其中，Pleosporalessp.，短枝霉属和叶点霉属为优势菌群，分别占总菌株数量的11.86%、8.47%和8.47%。阜康阿魏1～2年根的多样性指数最大，达到1.48。结论阜康阿魏在不同生长期及不同部位中的内生真菌分布及组成存在差异，具有一定的年份及组织专一性。

阜康阿魏；内生真菌；组成；分布

阜康阿魏FerulafukanensisK.M.Shen.系伞形科阿魏属FeruleL.多年生一次结实植物，是维吾尔族、蒙古族、回族等少数民族的传统民族药，仅分布于新疆准格尔盆地通古特沙漠边缘，属国家三级濒危药用植物，收录于历版《中国药典》，具有消积、化癥、散痞、杀虫等功效，临床上主要用于肉食积滞、淤血癥瘕、腹中痞块、虫积腹痛的治疗[1]。近年来由于发现其具有植物雌激素活性成分和抗癌物质而倍受人们关注[2-3]。

内生真菌(endophytic fungi)是指那些在生活史中的某一阶段生活于植物组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的真菌[4]。内生真菌可产生植物生长激素，促进宿主植物对氮、磷等营养元素的吸收，通过与病原菌竞争营养和空间或直接产生拮抗物质而抑制病原菌，从而促进植物生长[5]。本文研究阜康阿魏植物内生真菌的组成及分布，为进一步深入研究其作用机理及应用价值提供了理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样品 2012年5月采自新疆阜康市郊，分别为1～2年、3～4年、大于5年生长期和开花期的根、叶及花茎。经李晓瑾研究员、王果平副研究员鉴定为阜康阿魏FerulafukanensisK.M.Shen。

1.1.2 培养基 麦麸液体(固体)培养基：麦麸30 g·L-1，煮30min，取汁，葡萄糖20 g·L-1，磷酸二氢钾3 g·L-1，硫酸镁1.5 g·L-1，琼脂12 g·L-1，pH自然。PDA培养基[6]，在纯化期使用时，待冷却至60 ℃左右加入0.1%的链霉素；在纯化待保藏使用时，不加链霉素。

1.2 方法

1.2.1 内生真菌的分离、纯化及保藏 分别取不同样品，依次用75%乙醇1 min，3%次氯酸钠8 min消毒，无菌水洗涤5次，沥水；干后切成0.5 cm×0.5 cm，分别置于麦麸培养基上，每皿5～7块，每样品10皿，以无菌水涂布为对照，置于25 ℃暗培养。定时观察，有菌丝长出后，挑取菌丝尖端转入含有链霉素的PDA培养基中逐级纯化，纯化后内生菌转入不含链霉素的PDA培养基中。所获内生真菌一半置10%甘油中，-80 ℃保藏；一半转入含PDA培养基的冻存管中，待菌丝长满培养基表面时，4 ℃保藏。

1.2.2 内生真菌的鉴定

(1)形态学鉴定

在干净的载玻片上加1滴5% KOH溶液，用胶带粘取菌落表面部分菌丝及孢子等，代替盖玻片置于载玻片上，用滤纸吸干周围多余的液体，制成玻片，在显微镜下观察并记录孢子形态、产孢结构和菌丝形态等。根据所观察形态特征对分离获得的内生真菌进行鉴定[7-9]。

(2)分子鉴定

采用CTAB法提取所得内生真菌的基因组DNA，并作为模板，以通用引物ITS1(5′-TCCGTAGG TGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3′)对菌株进行ITS区域扩增。

PCR：①反应体系(25μL体系)：PCR mix 12.5 μL，ITS1和ITS4各0.5 μL，模板DNA 2 μL，双蒸水补足25 μL。②PCR反应条件：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32个循环，72 ℃温育7 min。③PCR产物的检测：1%的琼脂糖凝胶，1×TAE 电泳缓冲液电泳，样量3 μL，120 V电泳20～30 min。置凝胶成像系统中观察结果并拍照。

经金唯智生物技术(北京)有限公司测序，提交GenBank数据库，运用Blast搜索其同源序列，选择与靶序列最相近的菌种序列作参考；在多序列对比软件Clustal X 2.0中做同源性比较，并匹配排序；MEGA 4构建邻接(Neighbor-joining，NJ)树，结合序列比对，分析系统发育，鉴定不产孢菌株。

1.2.3 统计分析方法 采用分离频率(Isolation frequency，IF)比较和判断优势菌群；Shannon-Wiener多样性指数来分析内生真菌的菌群多样性。

2 结果

2.1 阜康阿魏内生真菌的组成

在549个组织块中共分离出内生真菌59株，可分为20个属(包括未鉴定出内生真菌9株)。其中，在阜康阿魏叶中分离得到23株内生真菌，分布于6个属；在阜康阿魏根中分离得到35株内生真菌，分布于16个属中；在阜康阿魏花茎中仅分离到1株内生真菌。所分离得到的内生真菌中，Pleosporalessp.分离频率最高，达到11.86%，且只分布于阜康阿魏1～2年根中。其次为短枝霉属和叶点霉属，分离频率均为8.47%(表1)。

表1 阜康阿魏内生真菌的分离频率

2.2阜康阿魏内生真菌的多样性分析

多样性指数结果表明：1～2年生长期的阜康阿魏根部多样性指数最大，从中分离到了28株内生真菌，分属于14个属，多样性指数达到1.48；其次为阜康阿魏的叶片，分离到15株内生真菌，分属于4个属，多样性指数达到0.70；多样性指数最小的是生长期>5年的阜康阿魏根及花茎，仅分离到1株内生真菌，多样性指数仅0.18(表2)。

表2 阜康阿魏内生真菌的多样性指数

2.3 系统发育分析

分离所得59株内生真菌根据进化亲缘关系可分为种群Ⅰ和种群Ⅱ，其中种群Ⅰ又可以进一步分为种群A和种群B。其中，种群B的自检支持率为100%，而种群A的自检支持率则较低，仅为41%。种群Ⅱ可以进一步分为种群C和种群D，自检支持率分别为78%和100%(图1)。

图1 阜康阿魏内生真菌的系统发育树

3 讨论

本研究从阜康阿魏中分离出59株内生真菌，分为20个属，其中根中分离出的内生真菌数量及种类最多，其次为叶，茎中最少，不同生长期不同部位既含有各自特有的专一性菌群也含有共有的广布菌群。造成这种现象的原因可能是组织结构不同、含有的营养物质不同，从而影响了内生真菌的侵染和分布。

本实验结果表明，阜康阿魏体内蕴含着比较丰富的内生真菌资源，且受组织、株龄和环境等因素的影响，表现出一定的组织及宿主差异性。通过对阜康阿魏内生真菌组成及分布的研究可以更好的探讨宿主植物与内生真菌的关系，丰富现有的内生真菌资源，为阿魏属植物内生真菌生物活性物质筛选、开发阿魏属药用植物的人工栽培新途径等工作提供了一定的理论和现实依据。

[1] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药出版社，2010：176.

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[3] Shi-Yong R，Chong-Ock L，Song-Un C，et al.Anticancer Composition Comprising Sesquiterpenes Isolated from Resina Ferula[P].US,20040043083 A1，2004，4.

[4] Carlile WR，Papadopoulos AP.The effects of environment lobby on the selection and use of growing media[J].Acta Hort，1999，481：587-596.

[5] 胡凤，程玉鹏，王振月，等.药用植物内生真菌研究现状及其应用前景[J].生物技术通讯，2008，19(5)：781-783.

[6] 沈萍.微生物学实验[M].北京：高等教育出版社，2004：215.

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[8] 裘维番.菌物学大全[M].北京：科学出版社，1998：59-300.

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The Composition and Distribution of Endophytic Fungi Associated with Ferula fukanensis K.M.Shen

ZHU Jun1，SUN Li1，2，LI Xiao-jin1，2*，ZHAO Li2，SHI Shu-bing2

(1.XinJiangInstituteofChineseTraditionalMedicaandEthicalMateriaMedica，Urumqi830002，China;2.Collegeofagricultural，XinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi830052，China;3.CollegeoftraditionalChinesemedicine，XinjiangMedicaUniversity，Urumqi830011，China)

Objective：In order to provide basic information for further study on mechanism and application of endophytic fungal ofFerulafukanensisK.M.Shen，the composition and distribution of endophytic fungi associated withF.fukanensiswere analyzed in the research.MethodsThe microbiology research methods and technology were used to isolate the endophytic fungi from different samples ofF.fukanensis，and this endophytic fungi were identified by ITSrDNA sequence analysis and morphology analysis.The Isolation frequency(IF)，Shannon-Wiener biodiversity index(H′)and Phylogenetic tree were used to analyze the composition，distribution and diversity of endophytic fungal community.ResultsA total of 59 strains endophytic fungi were isolated from theF.fukanensis，which were classified into 20 species.Among the 140 isolates，Pleosporalessp.，BrachycladiumpapaverisandPhyllostictawere the dominant generas，which can reach 11.86%，8.47% and 8.47% respectively.The Shannon-Wiener biodiversity index of 1-2 yearsF.fukanensiswas the highest，reached 1.48.ConclusionThere are notable differences between distribution and composition of the endophytic fungi isolated from different years and different parts ofF.fukanensis.

FerulafukanensisK.M.Shen；Endophytic fungi；Composition；Distribution

国家自然科学基金项目(81060265)；新疆维吾尔自治区自然基金(2011211B44)

*

李晓瑾，研究员，研究方向：中药学；Tel：(0991)2665614，E-mail：xjlxj@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.07.011

2014-03-04)