中药注射液体外肾细胞毒性评价的方法学探讨

阮浩澜等

[摘要] 目的 研究柴胡注射液和丹参注射液在犬肾近端小管上皮细胞（MDCK细胞）和人胚肾细胞（HEK-293细胞）模型的毒性作用，并探讨中药注射液体外肾细胞毒性检测的实验方法。 方法 选用马兜铃酸A作为阳性对照，将不同厂家和批次的丹参注射液、柴胡注射液的原液及稀释液，与MDCK细胞或HEK-293细胞共同孵育，通过四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）量化细胞毒性，计算相对增殖率，进行中药注射液体外肾细胞毒性评价。 结果 在MDCK细胞模型中，两批丹参注射4个液稀释浓度下毒性分级显示为0级，一批稀释9、27、81倍后显示为0级，柴胡注射液稀释27、81倍后显示为0级；在HEK-293细胞模型中，一批丹参注射液4个稀释浓度下毒性分级显示为1级，一批稀释9、27、81倍后显示为1级，一批稀释27、81倍后显示为1级；柴胡注射液稀释27、81倍后显示为2级。 结论 利用肾脏细胞来源的细胞，可尝试建立中药注射液体外肾细胞毒性检测的实验方法。

[关键词] 中药注射液；肾；细胞毒性；四甲基偶氮唑盐比色法

[中图分类号] R285.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）09（a）-0011-04

[Abstract] Objective To study the cytotoxicity of Salvia Injection and Bupleurum Injection in MDCK cells and HEK-293 cells and discuss the applicability of these experimental methods. Methods Aristolochic acid A was selected as a positive control drug. MDCK cells and HEK-293 cells were incubated with different concentrations of Salvia Injection or Bupleurum Injection. Then cytotoxicity was evaluated with MTT assay and relative growth rate （RGR） was calculated. Results In MDCK cell model， the RGR from two batches of Salvia Injection were shown as Class 0 after diluting 4 levels and one was shown as Class 0 after diluting 9， 27， 81 times. The RGR of Bupleurum Injection was shown as Class 0 after diluting 27， 81 times. Meanwhile， in HEK-293 cell model， the RGR from one batch of Salvia Injection was shown as Class 1 after diluting 4 levels. One batch of Salvia Injection was shown as Class 1 after diluting 9， 27， 81 times. One was shown as Class 1 after diluting 27， 81 times. The RGR of Bupleurum Injection was shown as Class 2 after diluting 27， 81 times. Conclusion The use of kidney-derived cells can help to establish experimental methods to test the Chinese medicine injection nephrotoxicity.

[Key words] Chinese medicine injection； Kidney； Cell toxicity； MTT assay

中药所致的肾脏损害在世界范围内日益受到重视，目前显示许多中药具有肾毒性作用[1]，中药肾毒性已经严重制约了中药在临床上的使用。中药注射液大部分都是经血管给药，其对肾脏损害的风险性更应提高警惕，如穿心莲内酯注射液已发现可导致患者急性肾损害[2]。因此，建立一个快捷有效的中药注射液肾毒性评价方法具有重要的意义。

目前体外细胞毒性试验广泛应用于生物材料、医疗器械和药品包装材料的毒性研究[3-5]，可以对受试物潜在的细胞毒性进行检测。在中药注射液方面，有研究选用小鼠成纤维细胞（L929细胞）进行体外细胞毒性的分析[6-7]，但用肾脏来源的细胞进行中药注射液的肾毒性体外评价的研究少见报道。本研究选用来源于肾脏的犬肾近端小管上皮细胞（MDCK细胞）和人胚肾细胞（HEK-293细胞），参考中药注射液在L929细胞毒性检测的四甲基偶氮唑盐比色法 （MTT法）[6]，考察中药注射液对MDCK细胞和HEK-293细胞的体外细胞毒性作用，对建立基于MDCK细胞或HEK-293细胞的中药注射液体外肾细胞毒性模型进行探讨。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

柴胡注射液（广东罗浮山国药股份有限公司，批号L13C302），丹参注射液（广东远大药业有限公司，批号130501、130502、130503）。马兜铃酸A（中国药品生物制品检定所，批号110746-200406）。马兜铃酸A用二甲基亚砜（DMSO，终浓度为0.5%）溶解，配成100 μmol/mL储存液。实验时，用DMEM培养液稀释至实验浓度。DMEM培养液（GIBCO公司），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）。胰酶（吉诺生物医药技术有限公司）。乳酸脱氢酶试剂盒（南京建成生物工程研究所）。其他试剂为国产分析纯试剂。