黑大蒜提取物联合抗生素对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的体外抗菌作用研究

李 岩，吕昌龙，桑力轩，吴素琴，王美惠，杨芳莉，孙 逊，王大南*

(1.中国医科大学基础医学院免疫学教研室，辽宁 沈阳 110001;2.辽宁卫生职业技术学院免疫与微生物教研室，辽宁 沈阳 110101;3.中国医科大学附属第一医院，辽宁 沈阳 110001)

大蒜素具有抗肿瘤、预防心脑血管疾病、抗衰老、抗微生物、抗溃疡、提高机体免疫力等多种药理作用［1-2］。体内外实验证明，大蒜素对多种微生物及寄生虫有强大的抑制和杀灭作用，被称为植物广谱抗菌素。大蒜素抗菌谱广，对革兰阳性菌、革兰阴性菌、大肠埃希菌、沙门菌、葡球菌、链球菌、克雷白杆菌、变形菌、梭状杆菌均有明显抑制作用［3］。黑大蒜是一种新型大蒜加工产品，由新鲜大蒜经过一定的温度和湿度处理而制成，与新鲜大蒜相比，其S-烯丙基-L-半胱氨酸(S-allyl-L-cysteine，SAC)含量明显升高，且无刺激性气味，可直接食用。佐佐木的研究表明黑大蒜除具有明显的抗氧化和抗肿瘤作用外，也具有抗细菌和抗真菌作用［4］。本文就黑大蒜提取物与抗生素联合应用是否可降低抗生素对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌抗菌作用的使用量进行了体外研究，获得如下结果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黄色葡萄球菌ATCC 25923，大肠埃希菌ATCC 25922购于中国药品生物制品检定所。

1.1.2 药品 头孢唑林标准品(Cefazolin，200 mg/支，中国药品生物制品检定所，纯度:99.3%，批号:0421-9603);庆大霉素标准品(Gentamicin，200 mg/支，中国食品药品检定研究所，纯度:95.1%，批号:130326-201015);黑大蒜由日本弘前大学佐佐木甚一教授提供。

1.1.3 培养基与仪器 MH肉汤、普通营养琼脂、普通营养肉汤(杭州天和微生物试剂有限公司);比浊仪(法国生物梅里埃公司);连续微量加样器(美国Eppendorf公司);八导微量加样器(美国Eppendorf公司);96孔细胞培养板(美国Corning公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌液配制 从已分纯的待检细菌平板上挑取4～5个菌落，接种于3～5 mL MH肉汤培养基，于37℃培养6 h。菌液用MH肉汤混匀后经比浊仪校正浊度至0.5麦氏比浊标准，再用MH肉汤稀释至1.5×105cfu/mL备用。

1.2.2 抗菌药物储备液配制 头孢唑林用pH 6.0、0.1 mol/L的PBS缓冲液配制成终浓度为2048 mg/L的储备液，并稀释成1000 μg/mL的工作液;庆大霉素用蒸馏水配制成终浓度为2048 mg/L的储备液，并稀释成1000 μg/mL的工作液。以上药物经0.22 μm滤膜滤过除菌后备用。

1.2.3 黑大蒜提取物溶液配制 将100 g黑大蒜捣碎后，置1.5 L去离子水中煮沸2 h，待冷却后8000 r/min，4℃离心30 min，取上清液再次离心，将上清液转移至冻干瓶中，用真空冷冻干燥机制备干粉。将干粉用蒸馏水配制成1000 μg/mL的工作液，经0.22 μm滤膜滤过除菌后备用。

1.2.4 液体稀释法 参照2009年CLSI推荐的液体稀释法进行抗菌药物敏感试验。将各抗菌药物原液(1000 μg/mL)5.12 mL 加入 4.88 mL MH 肉汤中，混匀。吸出并分别加入第1管和第2管，每管1 mL，第2管经混合后吸出1 mL加入第3管，依次类推至第15管后，吸出1 mL弃去，即各管最终的药物含量依次为 512、256、…、0.03 μg/mL。另设MH肉汤培养基对照和待测菌生长对照。接下来，将已校正浓度的菌液依次加入各管中，每管0.05 mL，混匀，于37℃培养18 h后观察结果。

1.2.5 液体稀释法药敏结果判断标准 结果参照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)中液体稀释法的判定标准，肉眼未见细菌生长的药物最低浓度即为该待测菌最低抑菌浓度(MIC)。

1.2.6 黑大蒜提取物对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌时间-杀菌曲线的测定 取培养18 h的细菌分别接种于5 mL含不同浓度黑大蒜提取物的MH肉汤中，使细菌终浓度为1.5×105cfu/mL。黑大蒜提取物浓度分别为 MIC/4、MIC/2、MIC、4MIC。细菌生长对照管加入相应体积的MH肉汤，空白对照管加入黑大蒜提取物但不加细菌。于37℃恒温摇床培养(120 r/min)，分别于0、4、8、12、16、20、24 h 取培养液，在紫外分光光度计600 nm下测定OD值，以时间为横坐标，OD600为纵坐标绘制生长曲线。

1.2.7 联合药敏试验 采用微量肉汤稀释法，菌液配制与黑大蒜提取物溶液配制同上。将黑大蒜提取物溶液以MH肉汤倍比稀释成10个浓度，分别为 1000、512、…、2 μg/mL。将头孢唑林和庆大霉素分别用MH肉汤倍比稀释成10个浓度，即为 16、8、…、0.03 μg/mL。将配好的不同浓度的黑大蒜提取物溶液与头孢唑林或庆大霉素按棋盘法设计，两两组合加入96孔细胞培养板中，每种药物加入50 μL，再将已校正浓度的菌液100 μL加入孔中，37℃培养18 h后观察结果。

1.2.8 联合药敏试验结果判断 记录单独应用两药的最低抑菌浓度MIC甲药单用和乙药单用，并选择最佳组合效应时两药联合时各自的MIC甲药联用和乙药联用，以计算FIC指数。

FIC指数=MIC甲药联合/MIC甲药单用+MIC乙药联合/MIC乙药单用

FIC 指数≤0.5，协同作用

0.5 ＜FIC指数≤1，相加作用

1＜FIC指数≤2，无关作用

FIC指数＞2，拮抗作用

2 结果与分析

2.1 黑大蒜提取物对金黄色葡萄球菌的MIC测定结果

以头孢唑林对金黄色葡萄球菌的抑菌效果作对照，即头孢唑林对金黄色葡萄球菌的MIC值为0.25 μg/mL(临床推荐剂量内)，黑大蒜提取物对金黄色葡萄球菌的MIC值为256 μg/mL。

2.2 黑大蒜提取物对大肠埃希菌的MIC测定结果

以庆大霉素对大肠埃希菌的抑菌效果作对照，即庆大霉素对大肠埃希菌的MIC值为0.25 μg/mL(临床推荐剂量内)，黑大蒜提取物对大肠埃希菌的MIC值为256 μg/mL。

2.3 黑大蒜提取物对金黄色葡萄球菌的时间-杀菌曲线

结果如图1所示，不加药物的金黄色葡萄球菌对照的吸光度直线上升，而加入黑大蒜提取物后吸光度显著下降，细菌生长受到明显抑制。当加入浓度为MIC的黑大蒜提取物时，吸光度缓慢增长，说明细菌生长受到抑制。当达到培养16 h时，出现最低抑菌时间点，之后吸光度又有所升高。当加入浓度为4MIC的黑大蒜提取物时，吸光度一直处于最初水平，说明此浓度细菌生长受到显著抑制。结果证明黑大蒜提取物对金黄色葡萄球菌的体外抑菌作用呈现较强的浓度依赖性。

图1 不同浓度黑大蒜提取物对金黄色葡萄球菌的时间-杀菌曲线Fig.1 Time-bactericidal curve of the black garlic extracts with different concentration against Staphylococcus aureus

2.4 黑大蒜提取物对大肠埃希菌的时间-杀菌曲线

结果如图2所示，不加药物的金黄色葡萄球菌对照的吸光度直线上升，而加入黑大蒜提取物后吸光度显著下降，细菌生长受到明显抑制。当加入浓度为MIC的黑大蒜提取物时，吸光度增长缓慢且接近最初值，说明细菌数量增长缓慢。当加入浓度为4MIC的黑大蒜提取物时，吸光度一直处于较低水平，说明细菌生长受到显著抑制。黑大蒜提取物对大肠埃希菌的体外抑菌作用呈现较强的浓度依赖性。

图2 不同浓度黑大蒜提取物对大肠埃希菌的时间-杀菌曲线Fig.2 Time-bactericidal curve of the black garlic extracts with different concentration against Escherichia coli

2.5 黑大蒜提取物与头孢唑林联用对金黄色葡萄球菌的MIC测定结果

黑大蒜提取物联合头孢唑林对金黄色葡萄球菌的MIC测定结果见表1，FIC指数为0.75，结果显示黑大蒜提取物联合头孢唑林对金黄色葡萄球菌的抗菌作用表现为相加作用。

表1 黑大蒜提取物与头孢唑林联用对金黄色葡萄球菌的MIC(μg/mL)Table 1 Table1 The MIC of black garlic extracts combined with Cefazolin against Staphylococcus aureus(μg/mL)

2.6 黑大蒜提取物与庆大霉素联用对大肠埃希菌的MIC测定结果

黑大蒜提取物联合庆大霉素对大肠埃希菌的MIC测定结果见表2，FIC指数为0.5，结果显示黑大蒜提取物联合庆大霉素对大肠埃希菌的抗菌作用表现为协同作用。

表2 黑大蒜提取物与庆大霉素联用对大肠埃希菌的MIC(μg/mL)Table 2 The MIC of black garlic extracts combined with Gentamicin against Escherichia coli(μg/mL)

3 讨论

金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌是医院感染的常见病原菌。随着抗生素的广泛使用，葡萄球菌属尤其是MRSA的检出率和耐药率有逐年增加的趋势，而耐药大肠埃希菌的检出率也在逐年攀升，这成为临床面临的非常棘手的难题［5］。单独使用一种抗菌药物对严重的细菌感染作用有限，并易诱导细菌耐药性，因此临床上越来越倾向于联合应用抗菌药物来控制耐药菌所致的严重感染。抗菌药物联合应用的意义在于可增强抗菌药物的协同抗菌作用，提高疗效;发挥两药迅速而强大的杀菌作用，避免诱导细菌耐药性的产生;并可减少毒性较大的药物剂量，降低不良反应［6］。因此，在新型抗菌药物面世之前，联合用药成为临床必不可少的治疗手段。大蒜素作为一种天然抗菌药物，具有一定的抑制病原菌和真菌的作用，并具有生物性能好、不良反应小以及具有免疫调节功能等特性。其抗菌原理在于大蒜素分子中的氧原子与细菌生长繁殖所必须的半胱氨酸中的巯基结合，抑制细菌生长繁殖［7］。但多数的体外抗菌活性研究发现，大蒜素MIC值较高，限制了它在抗感染治疗中的应用。已有研究报道黑大蒜较白大蒜含有更多的氨基酸、有机硫和S-烯丙基-L-半胱氨酸(S-allyl-L-cysteine，SAC)，具有较普通大蒜更强的抗衰老、抗氧化和抗肿瘤作用［8］。本研究结果显示，通过时间-杀菌曲线证明黑大蒜提取物对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均呈现较强的浓度依赖性。黑大蒜提取物与头孢唑林或庆大霉素联用后抗菌效果以相加和协同效应为主，并可显著降低两种抗菌药的MIC值。黑大蒜作为天然提取物，可在很大程度上避免两类抗菌药物联用后不良反应增加的情况，同时，因黑大蒜在体内有较强的免疫调节作用，更有益于感染性疾病的治疗。

［1］Pal R，Vaiphei K，Sikander A，et al.Effect of garlic on isoniazid and rifampicin-induced hepatic injury in rats［J］.World J Gastroenterol，2006，12(4):636-639.

［2］Shinkawa H，Takemura S，Minamiyama Y，et al.S-allylcysteine is effective as achemopreventive agent against porcine serum-induced hepatic fibrosis in rats［J］.Osaka City Med J，2009，55(2):61-69.

［3］Hiroyuki F，Kazuhiro W，Kazuhiro W，et al.Antibacterial potential of Garlic-derived allicin and its cancellation by sulfhydryl compounds［J］.Biosci.Biotechnol.Biochem，2009，73(9):1948-1955.

［4］Sasaki J，CH LU，Machiya E，et al.Processed black Garlic(allium sativum)extracts enhance anti-tumor potency against mouse［J］.Med Aroma J Plant Sci Biotech，2007，l(2):278-281.

［5］朱以军，徐瑞龙，单晓云，等.医院感染葡萄菌属的分布特点与耐药性［J］.中华医院感染杂志，2007，17(5):599-602.

［6］蔡芸，裴斐，郑砚君，等.大蒜素联合头孢唑林或苯唑西林对葡萄球菌的抗菌作用［J］.中国临床药理学与治疗学，2006，11(8):925-928.

［7］闻平，陈蕾，郭月芳.大蒜素对白色念珠菌生长的抑制作用［J］.微生物学杂志，2007，27(4):104-106.

［8］冯永辉，王庆辉，王美茹，等.黑大蒜提取物对小鼠细胞免疫应答影响的初步探讨.中国免疫学杂志［J］，2010，26(11):982-985.