三氧化二砷对支气管哮喘小鼠Th17细胞的影响

张 莉，范贤明，王文军，李 坑，向旭东

（1.泸州医学院附属医院呼吸内二科，四川 泸州 646000）；2.中南大学湘雅二医院急诊科，湖南 长沙 410011）

支气管哮喘（简称哮喘）是一种与免疫功能紊乱有关的慢性气道炎症性疾病，其中T细胞发挥着重要作用［1］。Th17细胞是一类新的T细胞亚群，主要通过分泌IL－17起作用。Th17／IL－17参与了多种炎症与自身免疫性疾病［2］。近期研究发现，Th17／IL－17可能在哮喘的发生发展中扮演着重要角色［3，4］。中医实践表明，三氧化二砷（Arsenic trioxide，ATO）具有良好的平喘作用，但机制不清楚，且关于ATO对哮喘Th17／IL－17的作用亦未见报道。本研究通过建立哮喘小鼠模型，观察ATO对哮喘小鼠的作用，尤其是对Th17细胞和IL－17的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 卵白蛋白（OVA，V级）、氢氧化铝凝胶、ATO（美国Sigma公司）；淋巴细胞分离液（中国达科为生物技术有限公司）；T细胞磁珠分离试剂盒、LS分离柱、Midi MACS磁珠分选器（德国 Milte－nyi公司）；FITC抗鼠IL－17A、固定剂、破膜剂（美国Biolegend公 司）；IL－4、IL－17ELISA 试 剂 盒 （美 国R＆D公司）。

1.2 动物分组及模型复制 30只SPF级雌性BALB／c小鼠，6～8周龄，体重（18～22）g，随机分为对照组、哮喘组、ATO组，每组10只。哮喘组及ATO组于第1、13天腹腔注射致敏剂0.2ml（含OVA 10 μg和氢氧化铝凝胶2mg），19天起以5%OVA雾化激发，每天30min，连续6天。ATO组每次激发前30 min腹腔注射2.5mg／kg ATO 0.2ml，哮喘组以等量PBS代替。对照组致敏激发用PBS代替。

1.3 小鼠处理及标本制备 末次激发24小时后，Buxco系统测量气道对乙酰甲胆碱（Mch）的肺阻力。收集左肺支气管肺泡灌洗液（BALF），细胞瑞士染色后分类计数。碾磨脾脏，淋巴细胞分离液制备脾单个核细胞悬液，免疫磁珠阳性分选T细胞。

1.6 ELISA检测细胞因子浓度 BALF及培养上清液中IL－17、IL－4测定采用ELISA法，参照试剂盒说明操作。

1.7 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件，数据以表示，采用单因素方差分析或独立样本t检验。简单直线相关性分析探讨两因素之间相关关系。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BALF中细胞计数及分类 与对照组相比，哮喘组BALF中白细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞显著增加（均P＜0.01）；与哮喘组相比，ATO组上述细胞数显著减少（均P＜0.05），见表1。

2.2 肺阻力检测 与对照组相比，哮喘组随着 Mch剂量递增表现出更显著的气道阻力；ATO组气道阻力显著低于哮喘组，见图1。

表1 各组BALF中白细胞总数和分类计数（×104／ml，n＝6，）Table 1 Classification and counting of white blood cell in BALF

表1 各组BALF中白细胞总数和分类计数（×104／ml，n＝6，）Table 1 Classification and counting of white blood cell in BALF

注：与对照组比较，①P＜0.01；与哮喘组比较，②P＜0.05

组别 细胞总数 嗜酸性粒细胞 淋巴细胞 中性粒细胞对照组 6.95±1.220.15±0.060.36±0.190.23±0.09哮喘组 21.11±3.28① 3.10±0.50① 6.60±0.97① 4.92±0.45①ATO组 13.04±2.58② 1.06±0.19② 2.43±0.28② 2.36±0.29②

图1 各组气道肺阻力比较Figure 1 Comparison of lung resistance in each group

2.3 Th17细胞阳性率比较 哮喘组脾脏Th17细胞阳性率［（12.2±2.2）%］显著高于对照组［（1.4±0.4）%，P＜0.01］；ATO组Th17细胞阳性率［（8.9±1.2）%］显著低于哮喘组（P＜0.01），见图2。

图2 各组脾脏Th17细胞阳性率比较Figure 2 Comparison of positive rate of Th17cells

表2 各组脾脏T细胞总数及BALF相关指标比较（n＝6，）Table 2 and IL－17and IL－4in BALF

表2 各组脾脏T细胞总数及BALF相关指标比较（n＝6，）Table 2 and IL－17and IL－4in BALF

注：与对照组比较，①P＜0.05；与哮喘组比较，②P＜0.05

组别 CD4＋T细胞（×108／L） IL－17（pg／ml） IL－4（pg／ml）对照组 6.9±0.8 97.6± 7.6 185.6±21.5哮喘组 17.9±2.1① 169.5± 8.3① 323.5±16.9①ATO组 12.9±2.3② 113.9±11.0② 248.3±19.0②

2.5 培养上清液中IL－17、IL－4浓度 ATO 干预组培养上清液中IL－17、IL－4浓度［分别为（7.9±1.5）、（42.7±5.0）pg／ml］均显著低于哮喘原液组［分别为（15.3±2.4）、（71.6±7.0）pg／ml，均P＜0.01］。

2.6 相关性分析 Th17细胞阳性率与BALF中性粒细胞数量呈显著正相关（r＝0.998，P＜0.05），BLAF中IL－17浓度与中性粒细胞数呈显著正相关（r＝0.982，P＜0.05）。

3 讨论

经典的“Th1／Th2失衡理论”并不能解释哮喘的全部：过继回输Th1细胞可以引起严重的气道炎症，Th1型细胞因子IFN－γ与抗原诱导的气道高反应性和嗜酸粒细胞浸润有关。近期支气管黏膜活检发现，重症哮喘患者气道Th17细胞数量及其分泌IL－17的功能明显增加［3］。Th17／IL－17对中性粒细胞具有强大的趋化作用，可导致气道局部炎症扩大或持久存在，介导激素抵抗型哮喘的气道炎症和高反应性［4］。Th17、IL－17是介导哮喘免疫源性气道炎症的重要原因［5］。

既往研究认为，小剂量ATO能促进嗜酸粒细胞凋亡、抑制NF－κB表达；能抑制骨髓嗜酸性粒细胞生成，降低血清和BALF中IL－5水平。但是关于ATO对哮喘T细胞，尤其是Th17、IL－17的研究未见报道。Th17细胞能通过IL－17介导气道中性粒细胞聚集，并可诱导Th2细胞介导的嗜酸性粒细胞炎症［6］。可见与嗜酸性粒细胞相比，Th17细胞处于炎症反应上游，对其进行探讨更有意义。本实验中，ATO干预组小鼠BALF中各类炎症细胞及气道肺阻力显著低于哮喘组，提示ATO能减轻气道炎症及高反应性。Th2细胞主要通过分泌IL－4等Th2型因子诱导嗜酸性粒细胞浸润参与哮喘发病［5］。我们发现，ATO组BALF中嗜酸性粒细胞数量及IL－4含量均较哮喘组明显下降；体外实验同样显示T细胞在ATO干预后分泌IL－4显著减少，提示ATO能够抑制Th2细胞的功能，减轻气道嗜酸性粒细胞性炎症。

部分哮喘患者对糖皮质激素治疗不敏感与气道中性粒细胞性炎症有关，因为糖皮质激素可对抗中性粒细胞凋亡［7］。本研究提示ATO能减轻气道中性粒细胞性炎症反应。ATO组Th17细胞阳性率、BLAF中IL－17含量均较哮喘组下降，体外实验也证实ATO能抑制T细胞分泌IL－17，提示ATO能抑制Th17、IL－17的表达。Th17／IL－17是介导哮喘气道中性粒细胞性炎症的重要原因［5］。相关性分析发现，Th17细胞阳性率、IL－17水平均与BALF中性粒细胞数量呈显著正相关，故我们推测ATO对哮喘的治疗作用除降低Th2效应外，还可能与减少Th17、IL－17产生，从而抑制中性粒细胞介导的气道炎症及高反应性有关。

4 结论

ATO能够抑制Th17及IL－17的表达，减轻哮喘小鼠气道炎症反应及高反应性。ATO可能对治疗糖皮质激素不敏感的中性粒细胞性哮喘有潜在价值。

［2］Xie Y，Chen R，Zhang X，et al.Blockade of interleukin－17Aprotects against coxsackievirus B3－induced myocarditis by increasing COX－2／PGE2production in the heart［J］.FEMS Immunol Med Microbiol，2012，64：343－351.

［3］Pène j，Chevalier S，Preisser L，et al.Chronically inflamed human tissues are infiltrated by highly differentiated Th17lymphocytes［J］.J Immunol，2008，180：7423－7430.

［4］Vazquez－Tello A，Halwani R，Hamid Q，et al.Glucocorticoid receptor－beta up－regulation and steroid resistance induction by IL－17and IL－23cytokine stimulation in peripheral mononuclear cells［J］.J Clin Immunol，2013，33：466－478.

［5］Cosmi L，Liotta F，Maggi E，et al.Th17cells：new players in asthma pathogenesis［J］.Allergy，2011，66：989－998.

［6］Wakashin H，Hirose K，Maezawa Y，et al.IL－23and Th17cells enhance Th2－cell－mediated eosinophilic airway inflammation in mice［J］.Am J Respir Crit Care Med，2008，178：1023－1032.

［7］Zijlstra GJ，Ten Hacken NH，Hoffmann RF，et al.Interleukin－17Ainduces glucocorticoid insensitivity in human bronchial epithelial cells［J］.Eur Respir J，2012，39：439－445.