斑褐孔菌石油醚提取物体外抗肿瘤活性研究

胡姗姗，刘 云，郭丹妮，朱欣婷，田应彪

1遵义医学院药学院;2遵义医学院医学与生物学研究中心;3遵义医学院附属医院，遵义 563000

斑褐孔菌［Fuscoporia punctata(Fr.)Cunn］为多孔菌科(Polyporaceae)，褐孔菌属(Fuscoporia)，又名层卧孔菌、斑点嗜蓝孢孔菌，生于阔叶树倒木上，主产于河北、吉林、江苏、陕西等地［1，2］。现代药理研究表明斑褐孔菌具有抗心肌缺血、调节心率、改善心功能、降压、阻滞肾上腺素能β-受体的作用，还具有凝血活性，可治疗心绞痛、痛经闭经等疾症［3-5］。在预实验中，课题组发现斑褐孔菌提取物表现出较好的体外抗肿瘤活性，课题组由此推测斑褐孔菌可能含有抗肿瘤活性的先导化合物。本研究对其极性较小的石油醚提取部分进行了抗肿瘤活性的初探，旨在为后期捕捉具有抗肿瘤活性的先导化合物以及为其能在临床应用提供实验依据。

1 材料、试剂与仪器

1.1 实验材料

人肝癌细胞 SMMC-7721、人胃癌细胞 SGC-7901、人喉癌上皮细胞Hep-2由遵义医学院医学与生物学研究中心馈赠，斑褐孔菌采自吉林省敦化市。

1.2 主要试剂

RPMI-1640培养基、胎牛血清，美国 Gibco公司;DMSO、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、Tris，美国Amresco公司;磺酰罗丹明，美国 Sigma公司;GenMed通用型细胞周期流式细胞分析试剂盒，上海杰美基因医药科技有限公司;其余试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器

702型超低温冰箱、3131型CO2培养箱、全波长酶标仪，美国Thermo公司;R-210型旋转蒸发仪，瑞士Buchi公司;倒置相差显微镜，日本OLYMPUS公司;H-7650型透射电镜，日本日立公司;FACS Calibur流式细胞仪，美国BD公司。

2 实验方法

2.1 斑褐孔菌石油醚提取物的制备

斑褐孔菌子实体60℃烘干、粉碎、过60目筛。称取斑褐孔菌粉末100 g，1 L石油醚60℃连续回流提取两次，每次3 h。合并提取液，减压旋转蒸发除去溶剂，自然干燥后得斑褐孔菌石油醚提取物(以下简称PEFP)200 mg。实验前精密称取PEFP 10 mg，100 μL DMSO溶解，临用前用完全培养基稀释成所需浓度。

2.2 细胞培养

人肝癌细胞 SMMC-7721、人胃癌细胞 SGC-7901、人喉癌上皮细胞Hep-2用RPMI-1640完全培养基(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素)于37℃、5%CO2培养箱常规培养。待细胞生长至对数生长期，弃培养液，PBS冲洗，0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3比例传代继续培养。

2.3 SRB法测定PEFP的对肿瘤细胞增殖的影响

取对数生长期SMMC-7721、SGC-7901、Hep-2细胞，消化后调整细胞浓度为80000个/mL，每种细胞平行接种两块96孔板，分别为对照板(实验组:T0)和实验板(实验组:T)。每孔加入细胞悬液100 μL，平板周围一圈加入200 μL PBS，十字交叉摇匀，置培养箱培养20 h后，对照板细胞用预冷的50%三氯乙酸(TCA)固定，待测;同时实验板中加入 PEFP 100 μL(PEFP 终浓度分别为 10、20、40、60、80、100 μg/mL)，阴性对照孔(阴性对照组:C)加完全培养基，阳性对照空(顺铂:10 μg/mL)，每组设5个复

孔。继续培养48 h后取出培养板，TCA固定1 h，去离子水洗板，自然干燥，SRB染色，10 min后用醋酸洗板，自然干燥，200 μL Tris液溶解，530 nm 处测吸光度值(OD值)，按下列公式计算生长抑制率［6］。采用改良寇氏法计算PEFP对三种细胞的半数抑制浓度(IC50)。

Xm:lg最大剂量;I:lg(最大剂量/相临剂量);P:阳性反应率之和;Pm:最大阳性反应率;Pn:最小阳性反应率。

2.4 倒置相差显微镜观察PEFP对SMMC-7721细胞形态结构的影响

取对数生长期细胞，消化后调整细胞浓度为10000个/mL，取细胞悬液2 mL接种到25 cm2培养瓶，培养20 h后弃培养液，加入4 mL浓度为1/2 IC50的PEFP，并设阴性对照组。48 h后倒置相差显微镜观察SMMC-7721细胞形态结构的变化情况。

2.5 透射电镜观察PEFP对SMMC-7721细胞超微结构的影响

取对数生长期细胞，消化后调整细胞浓度为10000个/mL，取细胞悬液2 mL接种到25 cm2培养瓶，培养20 h后弃培养液，加入4 mL浓度为1/2 IC50的PEFP，并设置阴性对照组。继续培养48 h后，4%戊二醛固定，透射电镜待检。

2.6 流式细胞仪分析PEFP对SMMC-7721细胞周期分布的影响

实验前细胞处理及分组同实验方法2.5，每组三个重复，继续培养48 h。随后按GenMed细胞周期试剂盒说明书操作。收集细胞，加入1 mL预冷的GenMed清理液，300 g离心5 min，弃上清液。加入500 μL 预冷的 GenMed 1 号工作液(由 500 μL GenMed裂解液和2.5 μL的GenMed染色液以及10 μL的GenMed去干扰剂组成)，小心混匀，避光孵育1 h，再加入 500 μL 2 号工作液(由 500 μL 的GenMed保存液和4 μL的GenMed染色液组成)，混匀;移入细胞流式仪专用测试管。流式细胞仪待检。

2.7 统计方法

3 实验结果

3.1 PEFP对三种肿瘤细胞增殖的影响

由表1可知，PEFP对 SMMC-7721、SGC-7901、Hep-2三种肿瘤细胞表现出较为明显的抑制作用，抑制率随PEFP浓度的增加逐渐上升，且呈剂量效应关系。其中，PEFP对SMMC-7721的抑制作用最明显，在40 μg/mL时，抑制率高达46.96%，而在100 μg/mL浓度时，细胞趋于完全死亡。浓度为80 μg/mL时，抑制率和阳性对照相当。PEFP对三种细胞的 IC50分别为 52.72、69.18、58.88 μg/mL。

表1 PEFP对三种肿瘤细胞增殖的影响(±s，n=5)Table 1 Effect of PEFP on the proliferation of 3 tumor cells(±s，n=5)

表1 PEFP对三种肿瘤细胞增殖的影响(±s，n=5)Table 1 Effect of PEFP on the proliferation of 3 tumor cells(±s，n=5)

注:“-”表示无;*与阴性对照组比较，P＜0.05。Note:“- ”indicates not detected;* compare with negative control，P ＜0.05.

组别Group PEFP浓度PEFP concentration(μg/mL)SMMC-7721 SGC-7901 Hep-2 OD值OD value抑制率Inhibition rate(%)OD值OD value抑制率Inhibition rate(%)OD值OD value抑制率Inhibition rate(%)对照组Control(T0)- 0.26±0.00 - 0.31±0.00 0.25±0.00 -阴性对照组Negative control(C) - 1.41±0.05 - 1.41±0.03 1.68±0.07 -实验组Sample(T) 10 1.30±0.04* 9.57 1.29±0.03* 10.91 1.42±0.05* 18.18 20 1.16±0.06* 21.74 1.24±0.03* 15.45 1.35±0.06* 23.08 40 0.87±0.04* 46.96 1.11±0.04* 27.28 1.27±0.04* 28.67 60 0.62±0.06* 68.70 0.88±0.04* 48.19 0.90±0.06* 54.54 80 0.40±0.06* 86.96 0.77±0.03* 58.19 0.62±0.06* 74.13 100 0.28±0.01* 99.98 0.67±0.07* 62.28 0.47±0.02* 84.62顺铂Cis-platinum 10 0.46±0.05* 82.44 0.46±0.02* 86.50 0.57±0.01*77.37

3.2 PEFP对SMMC-7721细胞形态的影响

如图1A所示，阴性对照组的细胞生长旺盛，细胞膜完整，形态规则，细胞贴壁紧密。而如图1B所示，细胞经1/2 IC50浓度的PEFP作用48 h后，细胞数量明显减少，细胞间的连接减少，细胞体积变小、变圆、变亮，大部分细胞凋亡或坏死，细胞膜破裂，悬浮在培养液中。

图1 PEFP对SMCC-7721细胞形态的影响(×100)Fig.1 Effect of PEFP on the cellular morphology of SMCC-7721(×100)

3.3 PEFP对SMMC-7721细胞超微结构的影响

细胞经1/2 IC50浓度的PEFP作用48 h以后，对照组(图2A)细胞核浆并无异常，胞质内染色质丰富，可见多个核仁，胞浆内线粒体丰富，嵴致密，绒毛结构清晰;实验组(图2B)细胞核明显缩小，异染色质消散，线粒体肿胀，空泡化，绒毛断裂消失。

图2 PEFP对SMCC-7721细胞超微结构的影响Fig.2 Effect of PEFP on the cellular ultrastructure of SMCC-7721

3.4 PEFP对SMMC-7721细胞周期的影响

如表2和图3所示，细胞经1/2 IC50浓度的PEFP作用后，G0/G1期细胞增多，S期细胞明显减少。出现G0/G1期阻滞。

表2 PEFP对人肝癌细胞SMCC-7721细胞周期的影响(±s，n=3)Table 2 Effect of PEFP on the cell cycle of SMCC-7721(±s，n=3)

表2 PEFP对人肝癌细胞SMCC-7721细胞周期的影响(±s，n=3)Table 2 Effect of PEFP on the cell cycle of SMCC-7721(±s，n=3)

*:与阴性对照组比较，P＜0.05。*:Compare with Negative control，P ＜0.05.

组别Group PEFP浓度PEFP concentration(μg/mL)G0/G1(%)S(%)G2/M(%)阴性对照组Negative control 0 61.95±2.07 30.96±1.23 8.09±1.01实验组Sample 26.36 66.34±2.56*24.03±3.98*9.62±1.42

图3 PEFP对SMCC-7721细胞DNA含量的影响Fig.3 Effect of PEFP on the DNA content of SMCC-7721

4 讨论

斑褐孔菌在民间是作为一种用于治疗冠心病的药用真菌［7］，以它为原料制成的冠脉乐片已用于临床治疗心绞疼，但对于斑褐孔菌的药用价值的研究和利用不应仅限于此，还有待挖掘。本实验以石油醚为溶剂，提取其弱极性成分PEFP。利用SRB法证实了PEFP对人肝癌细胞SMMC-7721、人胃癌细胞SGC-7901、人喉癌上皮细胞Hep-2三种人恶性肿瘤细胞的体外增殖具有明显的抑制作用，且呈剂量效应关系。其中，PEFP对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用最强，IC50为52.72 μg/mL。细胞周期与肿瘤的关系是近年来抗肿瘤药物研究的热点，人类恶性肿瘤的分子特征是细胞周期调节失控，引起细胞分化的缺乏和细胞生长的失常，导致细胞无限增殖［8，9］。在实验中，课题组继续考察了 PEFP 抑制SMMC-7721细胞体外增殖可能的机制。本实验通过流式细胞仪监测了PEFP对SMMC-7721细胞周期的影响，发现PEFP能使SMMC-7721细胞G0/G1期细胞增多，S期细胞减少。由此推测PEFP能阻止SMMC-7721细胞由G0/G1期向S期转变，将细胞阻滞于G0/G1期，从而阻断细胞的生长与分裂，抑制细胞增殖，但引起SMMC-7721细胞G0/G1期阻滞的机制还有待研究。从Gl期进入S期是细胞增殖周期中的一个限速位点，临床使用的很多抗肿瘤药物可以引起肿瘤细胞的G0/G1期阻滞［10］。由实验结果我们推测，PEFP中可能会分离获得高效抑制SMMC-7721细胞增殖的单体化合物，此工作将会陆续开展。此次研究结果丰富了我国大型真菌斑褐孔菌的药理活性研究内容，并为进一步的开发利用这一药用真菌资源提供了理论依据。

1 Wu XL(吴兴亮).Fungi of Tropical China(中国热带真菌).Beijing:Science Press，2009.584.

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3 Guo YM(郭豫梅)，Guo MJ(郭梅杰).Comparative research on flavonoid content in different fermentative productions of Fuscoporia punctata Cunn..Technl Dev Chem Ind(化工技术与开发)，2008，37:9-11.

4 Li YJ(李永鉴).Blocking effect of Suscoporia punctata(Fr)Cunn tablet on β-receptor.J Fujian Coll Tradit Chin Med(福建中医药院学报)，1993，3:227-229.

5 Liu PJ(刘鹏举)，Shu Y(舒英)，Tang Y(唐咏)，et al.Coagulant activity of agglutinins for 17 kinds of fungi.J Liaoning Forest Sci Technol(辽宁农业科技)，2009，1:37-38.

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7 Ying JZ(应建浙)，Mao XL(卯晓岚)，Ma QM(马启明)，et al.Illustrates Handbook of Chinese Medicinal Mushroom(中国药用真菌图鉴).Beijing:Science Press，1987.167.

8 Hanahan D，Weinberg RA.The hallmarks of cancer.Cell，2000，100:57-70.

9 Hartwell LH，Kastan MB.Cell cycle control and cancer.Science，1994，266:1821-1828.

10 Schwartz GK，Shah MA.Targeting the cell cycle:A new approach to cancer therapy.J Clin Oncol，2005，23:9408-9421.