超声波辅助法提取紫苏叶总黄酮的研究

刘毅君，曾广烨，李爱贞

(集美大学生物工程学院，福建厦门361021)

0 引言

紫苏(Perilla frutescens)是国家卫生部首批颁布的药食兼用的60种中药之一［1-2］.紫苏叶含有蛋白质、黄酮类、挥发油、色素等化学成分［3］.黄酮类化合物 (flavonoids)，又名生物类黄酮化合物(bioflavonoids)，泛指两个具有酚羟基的苯环通过中央三碳链相互连结而成的一系列化合物，分为黄酮类、异黄酮类、查尔酮类、花色素类及黄烷酮类等.黄酮类化合物是一类重要的天然有机化合物，是植物在长期自然选择过程中产生的一类次生代谢产物，它具有多种生物活性和药理作用，如防癌抗癌、抗肿瘤、抗心血管疾病、抗骨质疏松、消除自由基和抗氧化活性、雌激素样与抗雌激素样作用、对酒精中毒的解毒作用和治疗酒依赖的作用等［4-5］.黄酮类化合物的提取方法主要有:有机溶剂提取法、超声辅助提取法、微波提取法、超临界萃取法、酶辅助提取法、碱性水或碱性稀醇提取法等.超声波辅助提取法利用超声波机械效应、空化效应及热效应加速细胞内物质释放、扩散及溶解，它的提取时间短、提取温度低、回收率高、氧化损耗小，在中草药等天然物质有效成分提取中应用广泛［6-10］.本文拟以超声波辅助乙醇溶液提取紫苏叶中总黄酮，以期确定最佳提取条件.

1 材料与方法

1.1 材料及预处理

2013年7—9月采收于集美大学生物工程学院自种、无病虫害的紫苏叶，洗净、沥干，于60℃恒温干燥箱中烘干，粉碎，40目过筛，粉末再经60℃烘干至恒重，密封于PET瓶中避光保存备用.

1.2 超声波辅助提取紫苏叶总黄酮单因素试验

超声波辅助法提取紫苏叶总黄酮的工艺流程:紫苏叶粉末→乙醇浸提，超声波处理→恒温水浴浸提→离心→收集上清液→旋转蒸发→冷冻干燥→紫苏叶总黄酮粗提物.

1)提取剂的体积分数 准确称取0.500 g紫苏叶粉末 (以下处理均同)，按1∶30料液比 (g∶mL)，分别加入提取剂20%、30%、40%、50%、60%、70%(体积分数)乙醇溶液，与紫苏叶粉末混合，浸提.25℃下，对混合液超声 (80 kHz、200 W)处理30 min.置于60℃恒温水浴锅中浸提1 h，离心，取上清液，用亚硝酸钠-硝酸铝分光光度法［9］测定A500值，试验重复3次 (下同).

2)料液比 按1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 和 1∶60 的料液比 (g∶mL)，将紫苏叶粉末与体积分数为50%的乙醇溶液混合，浸提.25℃下，对混合液超声 (80 kHz、200 W)处理30 min.后续处理同1).

3)超声处理时间 料液比为1∶30，将紫苏叶粉末与体积分数为50%的乙醇溶液混合，浸提.25℃下，对混合液分别进行超声处理10、30、50、70、90、110 min.后续处理同1).

4)水浴浸提温度 料液比1∶30，将紫苏叶粉末与50%的乙醇溶液混合，浸提25℃下对混合液超声 (80 Hz、200 W)处理30 min，然后分别在40、50、60、70、80、90℃的水浴温度下浸提1 h，后续处理同1).

表1 正交试验因素水平设计Tab.1 Orthogonal experiment of four factors at three levels

1.3 超声波辅助提取紫苏叶总黄酮正交试验

在上述单因素试验的基础上，按照表1的因素水平建立L9(34)正交表，设计正交试验.

1.4 紫苏叶总黄酮含量分析

1.4.1 芦丁标准液、紫苏叶总黄酮粗提液最大吸收波长测定及芦丁标准曲线的制作

精确称取芸香叶苷·三水标准品至容量瓶中，用体积分数30%乙醇溶解配制0.500 mg/mL的芦丁标准溶液100 mL.取芦丁标准液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 mL于10 mL容量瓶中，各用体积分数30% 乙醇溶液补至4 mL，再各加入质量分数5%Na2NO2溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min.各加质量分数10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min.再各加质量分数4%NaOH溶液2 mL，摇匀，以体积分数30% 乙醇溶液定容至10 mL，摇匀，静置15 min.以芦丁含量为0的处理为空白对照，对不同浓度的芦丁标准液在400～800 nm下扫描测定最大吸收波长，并测定其吸光度值A，绘制标准曲线并计算回归方程.用同样方法测定紫苏叶乙醇提取液及其与芦丁标准液等体积混合液的最大吸收波长.

1.4.2 超声波辅助法浸提紫苏叶总黄酮的测定

按试验设计的处理方法，对紫苏叶粉末进行处理，准确吸取2.00 mL样品上清液于10 mL比色管中，用亚硝酸钠-硝酸铝分光光度法，测定其在吸收波长下的吸光度值A，根据回归方程，计算紫苏叶浸提液中的总黄酮含量，单位为mg/g.

1.4.3 验证试验

准确称取0.500 g紫苏叶粉末5份，以正交试验得出的最佳提取工艺进行5次平行试验，分别按照1.4.2中的方法进行总黄酮含量的测定.

1.4.4 精密度试验

以正交试验得出的最佳提取工艺进行5次平行试验，然后分别准确量取2.00 mL待测液于5个10 mL比色管中，分别按照1.4.2的方法进行总黄酮含量的测定.

1.4.5 回收率试验

准确称取已知总黄酮含量的紫苏叶粉末5份，每份0.500 g，以正交试验得出的最佳提取工艺进行5次平行试验，并分别测定总黄酮含量.然后分别准确吸取1.00 mL待测液于5个10 mL比色管中，并在每管加入0.20 mL的0.500 mg/mL芦丁标准溶液，然后分别按照1.4.2的方法进行总黄酮含量的测定，计算回收率.

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长和标准曲线

芦丁标准品溶液、紫苏叶乙醇提取液、标准液和提取液的混合液，其最大吸收波长均在500 nm处(见图1)，故选择500 nm为测量波长.

以吸光度值A为横坐标、芦丁标准品含量M(mg/mL)为纵坐标，绘制标准曲线.并得到回归方程为:Y=11.674 X+0.0173，R2=0.9991.本方程可用于计算紫苏叶提取液中总黄酮的含量.

2.2 超声波辅助提取紫苏叶总黄酮的单因素试验

结果表明，在单因素实验中，以体积分数40%乙醇溶液为提取剂时，其提取效果最好，总黄酮含量达到18 mg/g(如图2);料液比为1∶30时，紫苏叶的总黄酮得率最高，为16 mg/g(如图3);超声处理70 min(如图4)及70℃水浴提取效果最好 (如图5).

图2 乙醇浓度对总黄酮提取得率的影响Fig.2 The effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoid

图3 料液比对总黄酮提取得率的影响Fig.3 The effect of ratio of solid to liquid on the extraction rate of total flavonoid

2.3 超声波辅助提取紫苏叶总黄酮工艺条件的正交试验

按表1设计的正交表进行正交试验，试验结果见表2，直观分析图见图6.由表2及图6可知，提取紫苏叶总黄酮最佳工艺条件为A1B3C3D3，即:乙醇体积分数为30%，料液比1∶40，超声时间70 min，水浴温度80℃.各个因素对紫苏叶总黄酮提取效果的影响程度依次为:D(水浴温度)＞C(超声时间)＞A(乙醇浓度)＞B(料液比).采用极差法分析并进行差异显著性测定，结果表明:水浴温度对紫苏叶总黄酮提取效果的影响达到显著水平.

图4 超声处理时间对总黄酮提取得率的影响Fig.4 The effect of ultrasonic processing time on the extraction rate of total flavonoid

图5 水浴温度对总黄酮提取得率的影响Fig.5 The effect of bath temperature on the extraction rate of total flavonoid

表2 正交试验结果Tab.2 The orthogonal experiment results

2.4 验证试验

按照选定的条件A1B3C3D3进行5次平行试验，结果见表3.总黄酮提取率均高于正交试验表中的任何一组，且试验结果稳定，重现性好.表明超声波辅助提取紫苏叶总黄酮工艺可靠，相对标准偏差小、工艺稳定可行.

图6 直观分析图Fig.6 Intuitive analysis diagram of the orthogonal experiment results

表3 验证试验结果Tab.3 The results of verification experiments

2.5 精密度试验

5次平行测定的实验结果相对偏差为1.03%，表明用分光光度法测定紫苏叶中总黄酮含量，精密度较高，所得数据精确.

2.6 回收率试验

平均回收率为95.97%，RSD=0.88%(n=5).说明方法的准确度好、结果可靠，用此工艺提取紫苏叶总黄酮是可取的.

2.7 浸提次数对总黄酮提取得率的影响

在正交试验结果的基础上，对紫苏叶分别提取 1、2、3、4次，提取率分别为20.43、21.59、21.87、21.95 mg/g，随着提取次数的增加，黄酮得率增加，超过2次后提取率变化不大.因此，从节约成本及提高提取效率的角度考虑，以提取2次为宜.

3 结论

以紫苏叶为材料，总黄酮 (以芦丁为标准品作参比)提取率为指标，通过单因素和正交试验，得到影响紫苏叶总黄酮提取率程度大小依次为:水浴温度＞超声波处理时间＞乙醇浓度＞料液比.极差分析表明:水浴温度对紫苏叶黄酮提取率有显著影响.超声波辅助提取紫苏叶总黄酮的最佳提取条件为:乙醇体积分数30%，料液比1∶40，超声波 (80 Hz、200 W)处理时间70 min，水浴温度80℃.在此条件下，提取2次，总黄酮提取率达21.81 mg/g.

对正交试验选定的条件进行验证，表明本文所述方法提取的总黄酮结果稳定，试验重现性好，结果可靠.精密度试验及加标回收试验法测得的结果表明，用紫外分光光度法测定紫苏叶中总黄酮含量的准确度高.因此，用此工艺提取紫苏叶总黄酮是可取的，适合用紫外分光光度法测定总黄酮的含量.

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