安徽道地药材断血流的愈伤组织诱导条件研究

陈宇 王芳 李耀亭

摘要 [目的]研究不同基础培养基及添加的植物生长调节剂浓度对断血流愈伤组织的诱导效果。[方法]通过配制不同的培养基，选择适宜诱导断血流愈伤组织的培养基;然后选用适宜的培养基，研究不同浓度的6-BA及NAA对断血流愈伤组织诱导的影响。[结果]MS、N6、B5、RM、Miller 5种基本培养基中，适合断血流愈伤组织诱导的基本培养基为MS;研究不同的生长素NAA及细胞分裂素6-BA浓度时发现，NAA为0.1 mg/L和6-BA为1.0 mg/L时，断血流组培效果较好。[结论]断血流组培效果最好的培养基是MS培养基中NAA为0.1 mg/L和6-BA为1.0 mg/L。

关键词 断血流;培养基;植物生长调节剂;诱导;愈伤组织

中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）33-11667-02

Research on the Condition of Calls Induction of Genuine Clinopodii polycephali of Anhui

CHEN Yu1， WANG Fang1， LI Yao-ting2*

（1. Xishan Biotechnology Company Ltd of Luan， Luan， Anhui 237005; 2.Plant Cell Engineering of West Anhui University Engineering Research Center of Anhui， Luan， Anhui 237012）

Abstract [Objective] The research aimed to study the effect of the media types and the concentration of plant growth regulator on the callus induction of Clinopodii polycephali. [Method] Choose the suitable culture medium from the preparation of different kinds of medium. In the appropriate culture medium cases， the effect of the different concentration of 6-BA and NAA on inducing callus of Clinopodii polycephali were studied.[Result]MS was best to induce callus of Clinopodii polycephali among MS， N6， B5， RM， Miller.The research of the different concentrations of auxin NAA and cytokinin 6-BA found that when NAA was 0.1 mg/L and 6-BA was 1.0 mg/L， the effect on inducing callus of Clinopodii polycephali was better. [Conclusion]The best suitable medium was MS with NAA 0.1 mg/L and 6-BA 1.0 mg/L.

Key words Clinopodii polycephali;Medium; Plant growth regulator; Induction; Callus

基金项目 安徽省科技攻关计划项目（12010402083）。

作者简介 陈宇（1988- ），女，山东枣庄人，硕士，从事中药材病虫害防治研究。*通讯作者，工程师，博士，从事中药材组培及栽培技术研究。

收稿日期 2014-10-15

断血流是1970年从安徽民间发掘出来的止血药，为皖西大别山道地中药，是唇形科植物风轮菜Clinopodium chinensis或荫风轮Clinopodium polycephalum的干燥地上部分;风轮菜载于1406年的《救荒本草》，荫风轮载于1848年的《植物明实图考》。风轮菜分布于浙江、江西、福建、广东、广西、贵州等地;荫风轮主要分布于江苏、安徽、广西、贵州、云南、四川等地。皖西大别山断血流年产量300 t左右，药材微苦、味涩、辛凉，其功能为凉血止血。2005版药典一部收载的断血流即为上述2种原植物。临床上应用于吐血、咯血、尿血、崩漏、外伤出血等[1-4]，用处较广，市场潜力良好。笔者通过试验研究不同的基础培养基以及添加的植物生长调节剂浓度对断血流愈伤组织的诱导效果，为进一步的诱导育种和斷血流皂苷A的工业化生物合成奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

六安霍山采集的断血流。

1.2 培养条件

在无菌室内进行培养，培养温度控制在（25±2）℃，光照强度 1 800～2 000 lx，每天光照 12 h。

1.3 试验方法

1.3.1 不同基本培养基对断血流愈伤组织诱导的影响。

1.3.1.1 培养基的配制。

以MS、N6、B5、RM、Miller为基本的培养基，附加蔗糖30 g/L、琼脂4 g/L、细胞分裂素6-BA（1.0 mg/L）和生长素NAA（0.1 mg/L）。将做好的培养基搅拌均匀，并用氢氧化钠将pH调整至5.8～6.0。

1.3.1.2 培养基的灭菌。将配制好的培养基分装到组培瓶中，用盖子封好，分装，封口、 标明培养基种类和日期，放入高压灭菌锅灭菌。

1.3.1.3 接种外植体。接种前，将断血流幼嫩的茎尖先用洗衣粉水溶液浸泡5～10 min，再用自来水冲洗30 min。将试验要用到的解剖刀、剪刀、镊子、培养皿等先放入超净工作台上，打开紫外灯照射 20 min。20 min 后携带外植体进入无菌室，用75%的乙醇擦拭超净工作台面、双手及接种工具。金属接种工具每次使用前均要在酒精灯上灼烧灭菌。先用 75%的乙醇对嫩叶进行表面消毒，再用0.1% 的 HgCl2灭菌 5～8 min，用无菌水冲洗5次，在灭菌过程中要不断摇晃试管，使其充分灭菌。如此重复进行 3 次灭菌，将已灭菌的断血流幼嫩的茎尖，在无菌条件下切成5 mm×5 mm大小的方块。分别接种到5种培养基上，每种培养基接种5瓶，每种培养基重复3次。

1.3.2 不同浓度的6-BA及NAA对断血流愈伤组织诱导的影响。

1.3.2.1 培养基的配制。

以MS为基本的培养基，附加蔗糖30 g/L、琼脂4 g/L、细胞分裂素6-BA和生长素NAA。将做好的培养基按照一定梯度加入激素搅拌均匀（表1），并用氢氧化钠将pH调整至5.8～6.0。分装，封口、标明浓度和日期。

1.3.2.2 培养基的灭菌。灭菌方法同“1.3.1.2”项的方法。

表1 以MS为基本培养基的不同激素浓度的培养基

1.3.2.3 接种外植体。

接种前的准备工作同“1.3.1.3”项，在超净工作台上，每个浓度的培养基接种 5 瓶，每瓶接种5个嫩茎小块，接种后标明接种时间。每个浓度重复3次。

2 结果与分析

2.1 5种基本培养基对断血流愈伤组织诱导的影响

从接种3周后不同基本培养基对断血流愈伤组织诱导的影响（表2）可以看出，MS培养基中原球茎出现率显著高于N6和B5培养基等，MS、N6、B5、RM培养基均能够诱导断血流原球茎外植体，但Miller基本培养基不能诱导断血流外植体的出现。由此可见，适合断血流愈伤组织诱导的基本培养基为MS。

表2 5种基本培养基对断血流愈伤组织诱导的影响

2.2 不同浓度的6-BA及NAA对断血流愈伤组织诱导的影响

从接种3周后不同浓度的6-BA及NAA对断血流原球茎形成的结果（表3）可以看出，不同浓度的6-BA及NAA对断血流形成原球茎的效果不同，培养基（1）和（2）上培养出的原球茎健壮度较好，且原球率的出现率较高，但比较而言培养基（1）诱导效果显著好于培养基（2）;培养基（3）和（4）上培养出原球茎数量少，且健壮度差。

表3 6 种不同浓度培养基对断血流愈伤组织诱导的影响

3 结论

断血流的组织培养研究在我国目前没有报道。该试验在总结前人研究成果[5-6]的基础上，研究了不同基本培养基和不同浓度的激素对断血流组培的影响。试验结果表明，培养基（1）即MS培养基中NAA 0.1 mg/L、6-BA 1.0 mg/L，在断血流组培中作用最好。

该组培最好的培养基诱导愈伤组织原球茎出现率为52%，较低，是生长素浓度的影响还是其他因素的影响，还需要进一步的研究。

参考文献

[1] 国家药典委员会.中国药典2005年版.一部[S].北京：化学工业出版社，2005：228-229.

[2] 马亚红，郭瑞清，韩丽峰.断血流颗粒对药物流产出血的影响[J].中国生育健康杂志，2006，16（3）：170-172.

[3] 李素紅，温兰英，张云，等.断血流片治疗功能性子宫出血49例[J].河南医药信息，2002，10（19）：45.

[4] 杨明英.断血流颗粒预防上环术后月经过多100例[J].医药论坛杂志，2004，25（1）：36-38.

[5] 朱秀峰，杨兰钦，张妙霞，等.唇形科若干香科植物组织培养[C]//陈振光.第二届全国植物组织培养、脱毒快繁及工厂化生产学术研讨会论文集.北京：中国农业科学技术出版社，2004.

[6] 赵银河.铁皮石斛愈伤组织诱导研究[J].种子，2012，31（12）：21-23.