人脐带间充质干细胞治疗热烟雾致急性肺损伤的实验研究

李嫣 樊毫军 侯世科 丁辉

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.09.013

基金项目：武警总部科研课题（WJHQ2010-08）

作者单位：300162 天津，中国人民武装警察部队后勤学院附属医院呼吸科（李嫣），医教部（樊毫军、侯世科、丁辉）

通信作者：樊毫军，Email：fanhaojun999@126.com

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是指严重感染、创伤、休克等打击后，出现以肺泡毛细血管损伤导致肺水肿和肺不张为病理特征的综合征^[1]。中重度热烟雾致吸入性肺损伤作为一种特殊类型的ALI/ARDS，目前治疗仍然主要是肺保护性通气、液体支持疗法、控制感染、抗炎因子、應用皮质激素和血管扩张剂等的治疗，其病死率仍在23%以上^[2]。美国国家健康组织估计ARDS/ALI的发病率约有75/100 000，病死率甚至高达40%～60%^[3]。肺损伤主要是血清和肺泡腔内促炎因子如IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β的升高^[4]，伴有肺泡上皮细胞、内皮的损伤以及肺泡毛细血管屏障的减弱。脐带源性间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）不但能够成为骨髓MSCs的理想替代物，而且具有来源丰富、取材方便，MSCs含量丰富、获得率高，多向分化潜能、增殖能力强和低免疫原性、低病毒感染率等优点；同时还克服了骨髓源MSCs随年龄增长或老化而增殖能力和分化能力下降^[5]等缺点。因此，本文将通过研究人脐带间充质干细胞（ human umbilical cord derived mesenchymal stem cells，u-MSCs）移植于热烟雾致肺损伤大鼠的组织修复机制，为人ALI的治疗提供新的治疗方案。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SPF级Wistar大鼠72只，体质量（200±10）g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。

1.2 实验设备

荧光倒置显微镜（奥林巴斯 IX71），全自动脱水机（久圣，JTS-120P），组织包埋机（久圣，JBM-B），轮转式石蜡切片机（莱卡，RM2245），组织挪片机（久圣，TP-D），组织烘片机（久圣，HP-D），无菌解剖剪、镊子、手术刀、眼科剪等（上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂）

1.3 实验试剂

5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）、SP组化试剂盒（北京优博奥公司）、DAB显色试剂盒（博士德生物工程有限公司）、兔抗鼠水通道蛋白-5（aquaporin，AQP-5）、兔抗鼠碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、兔抗鼠角蛋白（武汉博士德）、Polymer免疫组化双染试剂盒DS-0001（北京中杉金桥生物技术有限公司）、4%中性多聚甲醛固定液（Solarbio）。

1.4 实验方法

64只大鼠随机（随机数字法）分为A组正常对照组，静注生理盐水1 mL；B组实验对照组，静注1×106个u-MSCs的PBS 1 mL；C/D组热烟雾吸入损伤后2 h 静注/经气管滴入PBS 1 mL；E/F组热烟雾吸入损伤后2 h 经静脉注射/经气管滴入含1×106个u-MSCs的PBS 1 mL。致伤前每只大鼠自由摄食、饮水及活动。参照文献[6]制备热烟雾致大鼠ALI模型，并参照该文献评估致伤模型是否成功，致伤成功2 h后经气管及静脉注射三代u-MSCs（u-MSCs由武警总医院中心实验室细胞培养室赠送），移植前用荧光染料BrdU（10 mg/L）与三代u-MSCs 共培养72 h，并经细胞爬片免疫组化证实标记是否成功。

1.5 实验取材及检测指标

各组分别在移植u-MSCs后12 h、24 h、1周时间点分别处死4只。（1）标本留取：开胸，迅速取气管、肺及心肝肾，甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色，倒置显微镜观察。参照文献[7]进行肺损伤Smith评分。对肺不张、肺水肿、肺泡及间质出血、肺泡及间质炎症和透明膜，依次行0至4分计分：正常记为0分，病变范围小于1/4记为1分、1/4至1/2之间记为2分、1/2至3/4之间记为3分、整个视野记为4分，上述5项之和记为总肺损伤评分。每个标本取10个视野（×400倍），取其均数。（2）免疫组化染色显示u-MSCs在大鼠体内分布：将切片浸在3%H2O2新鲜配制的甲醇溶液中孵育，高压抗原修复，加入足量两种一抗混合物于切片上（BrdU、人水通道蛋白5、碱性磷酸酶、以及角蛋白抗体稀释度均为1∶ 100），孵育。每张切片加入混合二抗，湿盒中室温孵育。滴加DAB液，镜下观察切片显色情况。滴加AP-Red工作液，孵育后，镜下观察显色情况。滴加封片剂，水平放置，完全变干后显微镜观察并拍照。

1.6 统计学方法

计量资料均以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 17.0统计软件包进行统计描述、数据处理。不同时间点各组比较采用重复测量的方差分析；同一时间点不同组之间的比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著差法（LSD-t）。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠气管、肺及心肝肾病理观察

给予u-MSCs对正常大鼠肺脏无明显影响，A、B两组在三个时间点镜下观肺、气管、心肝肾属于正常结构。而热烟雾吸入后u-MSCs移植可显著改善肺病理性损伤，12 h、24 h、1周肺组织逐渐好转。经气管及静脉输入u-MSCs组在12 h、24 h均表现为可见少量支气管上皮细胞脱落至肺泡腔内，肺泡及支气管周围的中性粒细胞浸润较损伤组减少。气管黏膜上皮少许脱落，并可见少许血管扩张。1周肺泡融合较损伤组减少，肺泡间隔变宽不明显，肺水肿和肺不张也较损伤组改善。肺泡腔内中性粒细胞和红细胞数量较损伤组明显减少。气管结构相对更加完整，上皮脱落数量明显减少，炎症细胞浸润也明显减少，较损伤组明显减轻。

各时间点肺组织损伤评分见表1。方差齐性检验提示方差齐（F=0.680，P=0.554）。其中A与B组评分组间差异无统计学意义（P>0.05 ）；而E组较C组低、F组较D组低、E组较F组低、差异均具有统计学意义（P<0.05 ）。

2.2 免疫组织化学染色显示u-MSCs在大鼠体内分布

ABCD组未见阳性细胞（BrdU标记u-MSCs阳性即细胞核呈棕褐色）。E组和F组显示出BrdU标记的u-MSCs在热烟雾致肺损伤后2 h 经静脉和气管移植入大鼠体内，在12 h时间点能在损伤的肺和气管组织中找到少量阳性细胞；1周阳性细胞数依次较24 h多；在1周正常的心、肝、肾组织中可观察到少许阳性细胞（图1）。

2.3 免疫组织化学双染色显示u-MSCs分化为肺泡上皮细胞

在E、F组1周可见AQP-5、AKP、角蛋白和BrdU双染阳性细胞，即肺泡Ⅰ型、Ⅱ型上皮细胞膜和气管上皮细胞膜染为红色，细胞核染为棕黄色，说明u-MSCs在肺内能分化为肺泡Ⅰ型、Ⅱ型上皮细胞，在气管内能分化为气管上皮细胞（图2）。

3 讨论

迄今研究表明，ALI/ARDS的重要病理特征是肺血管通透性增加造成的肺水肿。肺泡上皮细胞的肺泡液体清除作用（alveolar fuid clearance，AFC）是机体清除肺泡内多余液体的重要途径，肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮细胞，尤其是后者与AFC关系最为密切。Matthay和Wierer^[8]第一次临床证实ALI/ARDS患者存在AFC功能障碍。因此，热烟雾吸入致大鼠ALI/ARDS的主要治疗应该是肺的功能细胞AT Ⅰ和AT Ⅱ以及气管、支气管的修复治疗。本实验采用免疫组化双染色，分别选择了AT Ⅰ和AT Ⅱ及气管上皮的特征性标记物水通道蛋白-5（AQP-5）、碱性磷酸酶、角蛋白（keratin）进行检测。综合考虑实验结果，认为u-MSCs可能通过以下方面发挥作用： （1）在体内能分化为肺泡Ⅰ型上皮细胞；（2）还可能分化为肺泡Ⅱ型上皮细胞；（3）在气管内能分化为气管上皮细胞；即u-MSCs移植能促进肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮细胞及气管上皮再生， 促进肺及气管组织恢复。同时，肺损伤大鼠移植u-MSCs后，明显降低肺损伤Smith评分，不仅如此，本研究在u-MSCs移植后1周大鼠ALI模型中，心、肾、组织中均可检测到BrdU标记的阳性细胞，这与国内其他研究相似^[9]。但是对于这种表达了阳性细胞的心、肝、肾，笔者目前只进行了病理组织切片，未发现明显异常，对于u-MSCs对心、肝、肾组织的长期影响，以及是否会产生肿瘤组织，尚有待下一步实验研究。

关于u-MSCs促进ALI/ARDS的组织修复的机制，首先是u-MSCs的多向分化潜能和“归巢”机制，学者公认MSCs具有多向分化潜能。大量研究显示MSCs能“归巢”至肺损伤和炎症区域，分化成为肺泡上皮细胞或肺血管内皮细胞等，这是发挥其功能的前提。肺损伤后，坏死肺组织细胞可能通過释放出一系列信号因子，引导表达特异性受体的干细胞移动并黏附于损伤处，这被认为是干细胞“归巢”的最主要机制。基质细胞衍生因子-1（stromal cell derived factors， SDF-1）及其受体CXCR4、受体c-kit、集落刺激因子、血管内皮生长因子和整合素等，大量细胞因子、蛋白水解酶及黏附分子等可能也参与了此过程^[10]。Rojas等^[11]发现MSCs对博莱霉素所致的肺损伤具有保护作用，同时伴有循环中粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）和粒细胞巨核细胞集落刺激因子（granulocytemegakaryocyte colony stimulating factor，GM-CSF）（两者被认为可以促进内源性干细胞的动员和迁移）的升高及炎性因子的降低，这种保护作用可能与u-MSCs分化为ATⅠ和ATⅡ有关。

实验中，需要决定细胞递送的合适的计量和途径。实验中应用的剂量范围是每个动物（主要是鼠）5×105 到5×106 个细胞，剂量反应并未报道，所以鼠的合适的剂量尚不知。目前有研究证实106是细胞移植较为理想的浓度^[12]，因此本实验采取经气管及静脉输注1×106个细胞。另外，经静脉和经气管途径注入都被证明有效。每种途径都有优点，经气管途径可以在纤维支气管镜下进行，可以明确瞄准肺内受损的区域。另外，经静脉途径可以提供更大的全身的系统的作用，减轻ALI经常伴有的多器官功能障碍。

但u-MSCs移植的上限浓度及最佳移植浓度， 以及如何保证 u-MSCs移植后的存活率及调节其向肺泡上皮细胞及气管上皮细胞的比例， 使其对热烟雾致肺损伤发挥最佳的修复作用，尚需进一步研究证实。国内有研究证实静脉移植的MSCs能归巢至烟雾吸入性肺损伤炎症反应明显的肺组织和气管组织，并分化成肺泡Ⅰ型、Ⅱ型和肺血管内皮细胞，可能参与了烟雾吸入性损伤的组织修复过程^[13]。Ortiz等^[14]证明在博来霉素致大鼠ALI后立即气管内或全身输入MSCs能减少随后的胶原沉着、纤维化及基质金属蛋白酶水平。不同时间点向博来霉素致肺损伤的大鼠输注MSCs后均能减轻肺纤维化的程度，而早期输入MSCs效果尤佳。因此本研究在热烟雾致大鼠ALI后2 h给予气管内及静脉输入u-MSCs。Ortiz等^[14]实验证明经气管移植MSCs，MSCs在肺的归巢和移植可能会因为透明质酸和骨桥蛋白质与CD44受体的结合而增加。博来霉素处理后可以增加肺组织的透明质酸的表达，在这些条件下，骨桥蛋白质mRNA水平也增加。免疫浸润细胞释放的细胞因子和丝裂原可能影响归巢、移植和MSCs的增殖状况。最后，博来霉素毒性致微血管系统的破坏也提供了一个非特异性机制，即MSCs获得了与肺组织的接触的增加。

综上所述，u-MSCs促进并参加ALI/ARDS的肺组织的修复过程，尽管这一机制的研究尚不深入，但是修复后的肺泡上皮细胞的液体清除率及气体交换功能是否保留，或者这种功能是增加还是减退，尚需要进一步探索证实。

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（收稿日期：2014-01-30）

（本文编辑：郑辛甜）

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