榛蘑粗多糖醇提提取工艺研究

李艳 王舒雅

摘要 [目的]研究优化用醇提法从榛蘑中提取粗多糖的工艺。[方法]以榛蘑为试材，通过L9（33）正交试验，研究了料液比、乙醇浓度、浸提时间对榛蘑粗多糖醇提提取率的影响。[结果]试验显示，乙醇浓度和浸提时间是影响榛蘑粗多糖醇提提取率的主要因素，榛蘑粗多糖醇提最佳提取工艺为料液比1∶10，乙醇浓度30%，时间3 h。[结论]研究可为榛蘑粗多糖的进一步开发利用提供参考。

关键词 榛蘑；多糖；醇提；提取工艺

中图分类号 S646 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）31-11100-02

Study on Ethanol Extraction Technology of Crude Polysaccharides from Armillariella mellea

LI Yan， WANG Shuya

（School of Life Science & Chemistry， Hulunber College， Hulunber， Inner Mongolia 021008）

Abstract [Objective] To optimize ethanol extraction technology of crude polysaccharides from Armillariella mellea. [Method] The effect of the ratio of material to liquid， ethanol concentration， extraction time on the extraction rate of crude polysaccharides from Armillariella mellea was studied through L9（33）orthogonal test. [Result] The results showed that ethanol concentration and extraction time are the main factors influencing the extraction rate of crude polysaccharides from Armillariella mellea. The optimum extraction processes were the ratio of solid to liquid 1∶10， ethanol concentration 30%， time of 3 h. [Conclusion] The study can provide reference for further development and utilization of crude polysaccharide from Armillariella mellea.

Key words Armillariella mellea； Polysaccharide； Ethanol extract； Extraction process

多糖是由單糖基通过糖苷键连接起来的。药理研究表明，植物多糖具有抗病毒、抗辐射、抗肿瘤、延缓衰老及增强免疫调节等作用，且某些多糖还具有降血脂、降血糖等作用，有的多糖还能诱导干扰素的产生^[1-2]。近年来，植物、海洋生物及菌类等来源的多糖已作为有生物活性的天然产物中的一个重要类型出现。据文献报道，已有100种植物的多糖被分离提取出来^[3]。

榛蘑营养丰富，富含大量钙、磷、铁、蛋白质、糖类、胡萝卜素、维生素C等微量元素和营养成分，是一般蔬菜的十几倍。榛蘑含有人体必需的多种氨基酸和维生素，具有抗癌防癌、防治某些呼吸道及消化道感染疾病、防治病毒性疾病、降低胆固醇、防止动脉硬化、稳定血压等功能，它对预防视力减退、夜盲也很有效果。近年来对多糖提取工艺的研究方法较多^[4-6]，如热水浸提法、醇浸提法、稀碱液浸提法、稀酸液浸提法^[7-8]。但用醇提法从榛蘑中提取粗多糖的工艺研究还鲜见报道。同时因为在稀酸、稀碱条件下，易使多糖发生糖苷键的断裂，部分多糖发生水解而使多糖的提取率减少，因此笔者采用乙醇浸提法提取榛蘑粗多糖。

1 材料与方法

1.1 材料

原料：榛蘑，产于黑龙江三江平原地区。

主要试剂：无水乙醇、95% 乙醇、丙酮、无水乙醚、蒽酮、浓硫酸、葡萄糖、三氯甲烷、正丁醇，均为分析纯，沈阳试剂厂。

主要仪器：DS1高速组织捣碎机，上海标本模型厂；电热恒温干燥箱，上海跃进医疗器械厂；数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；752N型紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；JA5003N型电子天平；

SHBⅢ型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司。

1.2 多糖的提取流程

将榛蘑原料水洗，在60 ℃烘干至恒重后将其粉碎，用90%乙醇脱脂，干燥，然后加入一定量一定浓度的乙醇，浸泡一定时间后提取，抽滤，重复3次，收集提取液弃去残渣。提取液蒸发浓缩至原体积的1/4得到浓缩液，浓缩液用2.5倍量95%（质量分数）乙醇醇析得粗多糖沉淀，离心，干燥后得未除蛋白的粗多糖产品。

1.3 粗多糖中蛋白质的去除

该试验采用Savage法脱蛋白。Savage法是利用蛋白质遇有机溶剂变性而不溶于水的特点而分离除去。用少量蒸馏水溶解粗多糖混匀后按4∶1的比例加入氯仿-正丁醇（4∶1）混合液，振摇20 min，可见凝胶状的蛋白质析出，用离心法除去，直至无乳白色变性蛋白质析出为止。

1.4 醇沉、洗涤

将除蛋白后的多糖溶液缓慢倒入3倍体积的95%乙醇中，4 ℃冰箱中醇沉24 h后取出，离心后取沉淀用95%乙醇、无水乙醇淋洗1次，丙酮、无水乙醚各淋洗2次后干燥，称重。

1.5 多糖含量的测定

该试验采用蒽酮-硫酸法测定总的多糖含量^[9-11]。蒽酮-硫酸法是利用糖类遇浓硫酸脱水生成糖醛或其衍生物，可与蒽酮试剂缩合产生有色物质，反应后溶液呈蓝绿色，于波长620 nm处有最大吸收。该试验先利用标准糖溶液将其用蒽酮试剂处理后在波长620 nm处的吸光度制作标准曲线，再测定待测样品溶液的吸光度，根据回归方程计算出多糖含量。

1.5.1 葡萄糖标准曲线的制作。

取6 只具塞试管，分别加入100 μg/ml 的葡萄糖标准溶液0、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 ml，以蒸馏水补充至2 ml，每管内含葡萄糖分别为0、15、30、45、60、75 μg。加入4 ml蒽酮试剂，摇匀，沸水浴加热15 min后取出，流动水冷却，用1 cm比色皿，在752N型紫外可见分光光度计上测定A620，重复测定3次取平均值。以葡萄糖量（μg）为横坐标，A620为纵坐标绘制标准曲线。

1.5.2 样品糖含量的测定。

取制得的粗多糖样品30 mg，蒸馏水溶解并定容到250 ml容量瓶中，充分混匀，从中取出2.00 ml溶液并加入4.00 ml蒽酮试剂，摇匀，沸水浴加热15 min，反应完毕后流动水冷却，在752N型紫外可见分光光度计上测定A620值。以2 ml水代替样品液，如上操作并作为空白对照。重复测定3次，取平均值。利用标准曲线计算样品中糖含量。

2 结果与分析

2.1 多糖含量的测定

在试验条件下，测得标准曲线数据见表1，并以葡萄糖量（μg）为横坐标，A620为纵坐标作图，得标准曲线见图1。

回归方程为：

Y=0.006X+0.001 1（相关系数R=0.999 8）。

多糖纯度（%）=[ 125X/（G×1 000）]×100%

式中，X为从标准曲线查得A620对应之样品的糖量（μg）；

G为测试样品的质量（mg）。

2.2 醇提提取榛蘑中可溶性多糖提取率的正交试验

2.2.1 正交試验设计和结果的直观分析。

要得到较高的提取率，就必须选择合适的提取条件。通过查阅资料得知影响多糖醇提提取的主要因素是：浸提的料液比、乙醇浓度和浸提时间。浸提料液比的选择依据：一般来说只要能将活性物质溶出，料液比中溶剂用量越小越好，因为料液比中溶剂用量过大时，会给以后的浓缩带来不便。乙醇浓度的选择依据：当乙醇浓度超过40%时，乙醇浓度增大，多糖得率急剧减小。这是因为体系的极性随乙醇浓度的增大而减小，由于“相似相溶”的缘故，所以具有极性的大分子多糖不易提取出来。浸提时间的选择依据：延长提取时间会提高提取率，但当细胞中的有效成分已完全溶出时，延长提取时间非但不能提高提取率，反而会增加提取液中杂质的含量^[12]。

由于上述原因，该试验选取浸提的料液比、乙醇浓度和浸提的时间3个因素。料液比（干燥样品的质量与乙醇溶液的质量之比）采用1∶5、1∶10、1∶15 3个水平，浸提乙醇浓度采用30%、40%、50% 3个水平，浸提时间采用1、2、3 h 3个水平做正交试验^[13]，因素水平见表2，试验结果计算及分析见表3。

从表3可知，乙醇浓度和浸提时间是影响榛蘑多糖醇提提取率的关键因素，在试验范围内，料液比的影响最小。榛蘑醇提提取工艺最优条件为A2B1C3，即料液比1∶10，乙醇浓度30%，提取时间3 h。

2.2.2 正交试验的方差分析结果。

正交试验的方差分析得出，FA=0.330，FB=1.121，FC=1.549，F临界值=5.140。由此看出，乙醇浓度和浸提时间的差异显著，对榛蘑多糖醇提提取率的影响起主要作用，料液比在此试验范围内没有显著性差异，对测定结果的影响较小。这与直观分析结果是相吻合的。

3 结论

该研究通过正交试验得到了榛蘑粗多糖醇提提取最佳的工艺条件，即料液比1∶10，乙醇浓度30%，时间3 h。乙醇浓度和浸提时间是影响榛蘑多糖醇提提取率的关键因素，在试验范围内，料液比的影响最小。

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