HPLC法同时测定遍地金中4种黄酮类成分的含量

邱海洋等

摘要：建立同时测定遍地金（Hypericum wightianum）药材中槲皮素、槲皮苷、木犀草素、山奈酚含量的高效液相色谱分析方法。采用Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，检测波长360 nm，柱温30 ℃，槲皮素、槲皮苷、木犀草素、山奈酚线性范围分别为0.078～2.340 μg、0.106～3.180 μg、0.04～1.200 μg、0.062～1.860 μg；遍地金中槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚的含量分别为0.385%、0.022%、0.012%和0.111%，该方法简便快速、准确实用。

关键词：遍地金（Hypericum wightianum）；高效液相色谱法；槲皮素；槲皮苷；木犀草素；山奈酚

中图分类号：O657.32； 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）16-3898-03

Abstract：To simultaneously determine the contents of quercitrin，quercetin，luteolin and kaempferol in harb Hypericum wightianum， the samples were separated on the column of Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm） eluted with methanol and water（0.04% phosphoric acid）. The sample size was 10 μL. The wavelength uesd was 360 nm and column temperature was 30℃. The linear ranges of quercitrin， quercetin ，luteolin and kaempferol were 0.078-2.340 μg，0.106-3.180 μg， 0.040-1.200 μg and 0.062-1.860 μg， respectively. The contents of four flavonoids from seven different areas in Qinghai province and different organs were 0.385%，0.022%，0.012% and 0.111%. The method was rapid and accurate.

Key words：Hypericum wightianum；HPLC；quercitrin；quercetin； luteolin；kaempferol

金丝桃属植物在抗抑郁、抑制中枢神经、抗肿瘤和抗病毒[1-3]方面的突出作用， 使得该属植物的研究受到国内外普遍关注[4]。遍地金（Hypericum wightianum）为藤黄科金丝桃属多年生草本植物，分布于云南、四川、贵州、西藏等地，有收敛止血、清热解毒的功效，民间用于治疗小儿炎症、久痢、久泻、毒蛇咬伤等疾病[5]。近期研究发现，该植物具有明显的抗抑郁作用[6]，该作用不仅与金丝桃素含量有关，还与植物中所含其他成分相关[7]。已有对该植物化学成分及分析方法的报道[8]，但未见对该植物中槲皮素、槲皮苷、木犀草素、山奈酚含量同时测定的报道。试验建立了同时测定上述4种成分含量的HPLC方法，为该资源后续开发利用及为新药源研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料 遍地金：2011年采自西藏林芝地区，阴干后粉碎备用。所用标准品槲皮苷（批号：111538-200403）、槲皮素（批号：100081-200406）、木犀草素（批号：111520-200201）、山奈酚（批号：110861-200707）均购自中国药品生物制品检定所。色谱纯甲醇为高效液相色谱专用试剂（山东禹王实业有限公司禹城化工厂）；水为娃哈哈纯净水；磷酸为AR级（天津市红岩试剂厂）。

1.1.2 仪器 Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）、AG204型电子分析天平（南京安铎贸易有限责任公司）、SHB—Ⅲ型循环水式多用真空泵（上海科兴仪器有限公司）、EYEL4型旋转蒸发仪（日本东京理化器械株式会社）。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱。流动相：甲醇（A）-0.2%的磷酸水（B），流动相在30 min内甲醇由35%线性增加至65%。流速1.0 mL/min；柱温30 ℃，检测波长360 nm；进样量10 μL。

1.2.2 样品溶液的制备 分别精密称取经五氧化二磷干燥过夜的槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚标准品适量，用色谱纯甲醇分别配置成0.78、1.06、0.40、0.62 mg/mL的储备液。

1.2.3 供试品溶液的制备 精密称取地黄金粉末1.014 g，置于三角瓶中，精密加入20 mL甲醇，密封室温下浸泡2 h，超声波处理2 h，冷却至室温，称重，用甲醇补足减少的重量，移至25 mL容量瓶甲醇定容，测加标回收率。

2 结果与分析

2.1 色谱图结果

对照品和样品色谱图见图1。由图1可知，槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚保留时间分别为15.1、22.1、27.1 min和28.2 min，遍地金中的槲皮素和山奈酚含量较高，槲皮苷和木犀草素较低。

2.2 标准曲线及线性范围

取标准品储备液稀释10倍后在选定的色谱条件下分别进样1、5、10、15、20、30 μL，以进样量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标做一元线性回归，4种黄酮类物质标准曲线分别为Y=1 807X-41.85、Y=3 309X-18.23、Y=2 363X-19.09、Y=3 246X-7.84，线性范围分别为：0.078～2.34 μg、0.106～3.18 μg、0.04～1.2 μg、0.062～1.86 μg，线性相关系数分别为0.999 6、0.999 7、0.999 7、0.999 8。endprint

2.3 精密度试验结果

量取标准品10 μL，在选定的色谱条件下测定5次，得到槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚峰面积的RSD分别为0.97%、0.91%、1.1%、0.81%，表明仪器精密度良好。

2.4 重复性试验结果

样品溶液在选定的色谱条件下进样10 μL，重复测定5次，得到槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚峰面积的RSD分别为1.6%，1.7%，1.2%，1.6%，表明重复性良好。

2.5 稳定性试验结果

取“1.2.3”中样品溶液，分别放置0、2、4、6、12 h后在“1.2.1”色谱条件下进样，每次进样10 μL，得到槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚峰面积的RSD分别为1.6%、1.4%、1.4%、1.7%，表明供试溶液在12 h内稳定。

2.6 加标回收率试验结果

精密称取遍地金粉末0.5 g共3份，分别添加标准品溶液：槲皮苷（0.78 mg/mL）2.28 mL、槲皮素（1.06 mg/mL）溶液0.11 mL、木犀草素（0.40 mg/mL）溶液0.15 mL、山奈酚（0.62 mg/mL）0.90 mL，按“1.2.3”操作，测得加标回收率分别为槲皮苷99.6%、槲皮素96.4%、木犀草素98.6%、山奈酚102.7%，说明准确程度良好。

2.7 样品测定

按选定的色谱条件测定遍地金样品中4种黄酮类成分的含量，进样量10 μL，以外标法定量，测得槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚的含量分别为0.385%、0.022%、0.012%和0.111%。

3 小结与讨论

本试验采用反相高效液相色谱法测定遍地金中4种黄酮类成分槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚的含量分别为0.385%、0.022%、0.012%和0.111%，该方法具有操作简便，准确度高，重复性好等优点，对该资源的评价、开发利用以及新药源研究具有一定的现实意义。

试验前期比较了甲醇、乙醇、水等不同溶液作为提取剂，结果以甲醇提取的黄酮含量较高，色谱峰形较佳，分离效果较好。考虑超声波提取方法简单，耗时少，所以选择超声波提取法，而没有选择热回流法。试验所测的4种黄酮成分在260 nm和360 nm处均有较大吸收，但260 nm处干扰较大，故选择360 nm做检测波长。

参考文献：

[1] LINDE K， RAMIREZ H， MULROW C D， et al. St Johns'wort for depression-an overview and meta-analysis of randomised clinicaltrials [J]. BMJ， 1996， 313（7052） ： 253-258.

[2] 潘映红，郭宝林，彭 勇.国产金丝桃属药用植物资源现状及利用前景[J].中药材，1993，16（3）：14-18.

[3] 江苏省植物研究所，中国医学科学院药物研究所.新华本草纲要[M].第一册.上海：上海科技出版社，1988.216-217.

[4] 石金城，孙兴华，刘 媛，等.遍地金不同提取物的抗抑郁作用[J].华西药学杂志，2012，27（2）：128-131.

[5] 赵 晶，何洪静，高 玮，等.遍地金提取物对大鼠脑突触体[3H]-去甲肾上腺素再摄取抑制作用[J].中国医院药学杂志，2003，23（7）：400-402.

[6] 陶曙红，吴凤锷.遍地金的化学成分研究Ⅱ[J].天然产物研究与开发，2004，16（1）：26-27.

[7] 陶曙红，吴凤锷.遍地金的化学成分研究[J].中草药，2004，35（2）：136-137.

[8] 郑清明，秦路平，郑汉臣，等.国产11种金丝桃属植物中化学成分的含量分析[J].第二军医大学学报，2003，24（4）：457-459.

（责任编辑 龙小玲）endprint

2.3 精密度试验结果

量取标准品10 μL，在选定的色谱条件下测定5次，得到槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚峰面积的RSD分别为0.97%、0.91%、1.1%、0.81%，表明仪器精密度良好。

2.4 重复性试验结果

样品溶液在选定的色谱条件下进样10 μL，重复测定5次，得到槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚峰面积的RSD分别为1.6%，1.7%，1.2%，1.6%，表明重复性良好。

2.5 稳定性试验结果

取“1.2.3”中样品溶液，分别放置0、2、4、6、12 h后在“1.2.1”色谱条件下进样，每次进样10 μL，得到槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚峰面积的RSD分别为1.6%、1.4%、1.4%、1.7%，表明供试溶液在12 h内稳定。

2.6 加标回收率试验结果

精密称取遍地金粉末0.5 g共3份，分别添加标准品溶液：槲皮苷（0.78 mg/mL）2.28 mL、槲皮素（1.06 mg/mL）溶液0.11 mL、木犀草素（0.40 mg/mL）溶液0.15 mL、山奈酚（0.62 mg/mL）0.90 mL，按“1.2.3”操作，测得加标回收率分别为槲皮苷99.6%、槲皮素96.4%、木犀草素98.6%、山奈酚102.7%，说明准确程度良好。

2.7 样品测定

按选定的色谱条件测定遍地金样品中4种黄酮类成分的含量，进样量10 μL，以外标法定量，测得槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚的含量分别为0.385%、0.022%、0.012%和0.111%。

3 小结与讨论

本试验采用反相高效液相色谱法测定遍地金中4种黄酮类成分槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚的含量分别为0.385%、0.022%、0.012%和0.111%，该方法具有操作简便，准确度高，重复性好等优点，对该资源的评价、开发利用以及新药源研究具有一定的现实意义。

试验前期比较了甲醇、乙醇、水等不同溶液作为提取剂，结果以甲醇提取的黄酮含量较高，色谱峰形较佳，分离效果较好。考虑超声波提取方法简单，耗时少，所以选择超声波提取法，而没有选择热回流法。试验所测的4种黄酮成分在260 nm和360 nm处均有较大吸收，但260 nm处干扰较大，故选择360 nm做检测波长。

参考文献：

[1] LINDE K， RAMIREZ H， MULROW C D， et al. St Johns'wort for depression-an overview and meta-analysis of randomised clinicaltrials [J]. BMJ， 1996， 313（7052） ： 253-258.

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[4] 石金城，孙兴华，刘 媛，等.遍地金不同提取物的抗抑郁作用[J].华西药学杂志，2012，27（2）：128-131.

[5] 赵 晶，何洪静，高 玮，等.遍地金提取物对大鼠脑突触体[3H]-去甲肾上腺素再摄取抑制作用[J].中国医院药学杂志，2003，23（7）：400-402.

[6] 陶曙红，吴凤锷.遍地金的化学成分研究Ⅱ[J].天然产物研究与开发，2004，16（1）：26-27.

[7] 陶曙红，吴凤锷.遍地金的化学成分研究[J].中草药，2004，35（2）：136-137.

[8] 郑清明，秦路平，郑汉臣，等.国产11种金丝桃属植物中化学成分的含量分析[J].第二军医大学学报，2003，24（4）：457-459.

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2.3 精密度试验结果

量取标准品10 μL，在选定的色谱条件下测定5次，得到槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚峰面积的RSD分别为0.97%、0.91%、1.1%、0.81%，表明仪器精密度良好。

2.4 重复性试验结果

样品溶液在选定的色谱条件下进样10 μL，重复测定5次，得到槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚峰面积的RSD分别为1.6%，1.7%，1.2%，1.6%，表明重复性良好。

2.5 稳定性试验结果

取“1.2.3”中样品溶液，分别放置0、2、4、6、12 h后在“1.2.1”色谱条件下进样，每次进样10 μL，得到槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚峰面积的RSD分别为1.6%、1.4%、1.4%、1.7%，表明供试溶液在12 h内稳定。

2.6 加标回收率试验结果

精密称取遍地金粉末0.5 g共3份，分别添加标准品溶液：槲皮苷（0.78 mg/mL）2.28 mL、槲皮素（1.06 mg/mL）溶液0.11 mL、木犀草素（0.40 mg/mL）溶液0.15 mL、山奈酚（0.62 mg/mL）0.90 mL，按“1.2.3”操作，测得加标回收率分别为槲皮苷99.6%、槲皮素96.4%、木犀草素98.6%、山奈酚102.7%，说明准确程度良好。

2.7 样品测定

按选定的色谱条件测定遍地金样品中4种黄酮类成分的含量，进样量10 μL，以外标法定量，测得槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚的含量分别为0.385%、0.022%、0.012%和0.111%。

3 小结与讨论

本试验采用反相高效液相色谱法测定遍地金中4种黄酮类成分槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚的含量分别为0.385%、0.022%、0.012%和0.111%，该方法具有操作简便，准确度高，重复性好等优点，对该资源的评价、开发利用以及新药源研究具有一定的现实意义。

试验前期比较了甲醇、乙醇、水等不同溶液作为提取剂，结果以甲醇提取的黄酮含量较高，色谱峰形较佳，分离效果较好。考虑超声波提取方法简单，耗时少，所以选择超声波提取法，而没有选择热回流法。试验所测的4种黄酮成分在260 nm和360 nm处均有较大吸收，但260 nm处干扰较大，故选择360 nm做检测波长。

参考文献：

[1] LINDE K， RAMIREZ H， MULROW C D， et al. St Johns'wort for depression-an overview and meta-analysis of randomised clinicaltrials [J]. BMJ， 1996， 313（7052） ： 253-258.

[2] 潘映红，郭宝林，彭 勇.国产金丝桃属药用植物资源现状及利用前景[J].中药材，1993，16（3）：14-18.

[3] 江苏省植物研究所，中国医学科学院药物研究所.新华本草纲要[M].第一册.上海：上海科技出版社，1988.216-217.

[4] 石金城，孙兴华，刘 媛，等.遍地金不同提取物的抗抑郁作用[J].华西药学杂志，2012，27（2）：128-131.

[5] 赵 晶，何洪静，高 玮，等.遍地金提取物对大鼠脑突触体[3H]-去甲肾上腺素再摄取抑制作用[J].中国医院药学杂志，2003，23（7）：400-402.

[6] 陶曙红，吴凤锷.遍地金的化学成分研究Ⅱ[J].天然产物研究与开发，2004，16（1）：26-27.

[7] 陶曙红，吴凤锷.遍地金的化学成分研究[J].中草药，2004，35（2）：136-137.

[8] 郑清明，秦路平，郑汉臣，等.国产11种金丝桃属植物中化学成分的含量分析[J].第二军医大学学报，2003，24（4）：457-459.

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